2.2. 显微镜观察
将耻垢分枝杆菌杆菌悬浮于PBS中，使用Diphot 300倒置显微镜在相衬显微镜下观察。如前所述进行新生肽聚糖的标记。
2.3. 用于过表达研究的PknB构建体的生成
pknB基因及其变体从结核分枝杆菌H37Rv DNA中扩增，并克隆到pMind质粒的BamHI和SpeI位点。通过测序确认构建体，并电转化到耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌中。通过添加四环素诱导pknB或其变体的过表达，并通过qRT-PCR确认。
2.4. 胞壁肽的制备
如前所述分离和纯化来自大肠杆菌和分枝杆菌的肽聚糖。对于生长测定，用变溶菌素、溶菌酶、RpfB或MltA在37°C消化肽聚糖长达72小时。在单独的实验中，将肽聚糖超声处理三次，短暂离心以去除大片段，并用于生长测定。如前所述制备合成胞壁肽。
2.5. 选定抗菌剂的最低抑菌浓度测定
在96孔微量滴定板中使用稀释法进行测试。将耻垢分枝杆菌接种在补充了卡那霉素和四环素以及一系列待测抗菌剂浓度的Sauton培养基中。将板在37°C培养三天。MIC确定为培养3天后未检测到可见生长的最低浓度。每次实验都准备新鲜的抗菌剂原液。
2.6. 重组PASTA蛋白对结核分枝杆菌生长的影响
如前所述纯化重组PASTA，并在生长实验前过滤除菌。将分枝杆菌接种到含有不同浓度无菌rPknB_PASTA的补充7H9培养基的16孔微量滴定板中。每个浓度接种四个重复。密封板在37°C不摇动培养。在培养15天和25天后测量光密度。实验重复两次。当分枝杆菌在Falcon管或锥形塑料瓶中生长时获得类似结果。将结核分枝杆菌稳定期培养物在4°C储存两个月，然后接种到锥形瓶中。将烧瓶在37°C培养长达12周。使用Jenway分光光度计定期测量光密度。
2.7. 转录谱分析
使用TRIzol法从指数生长期的10 ml分枝杆菌培养物中分离总RNA。在cDNA生成前，使用Turbo DNA-free DNAase去除DNA污染。使用基因特异性引物在Corbett Rotor Gene 6000实时热循环仪中进行Q-PCR。将表达水平标准化为16s rRNA。
2.8. 蛋白质电泳和Western印迹
通过离心收集分枝杆菌，在PBS中洗涤，并重悬于缓冲液中。在FastPrep-24仪器中使用玻璃珠裂解细菌。裂解物离心以分离可溶性和不溶性部分。使用12% SDS PAGE分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。使用抗多组氨酸抗体作为一抗；使用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠抗体作为二抗。使用Sigma Fast BCIP/NBT作为底物来显色识别的蛋白质。
2.9. 用于蛋白质组学分析的膜蛋白部分的分离
如前所述制备膜组分。简单来说，将耻垢分枝杆菌TMP和MIND菌株接种在含有Sauton培养基的锥形瓶中。将培养物在37°C摇动培养。从两个烧瓶中收集培养物用于制备每个菌株的膜组分。在冰上搅拌细胞悬浮液，然后超声处理。悬浮液离心，弃去沉淀。上清液超速离心。弃去上清液后，将沉淀小心重悬于碳酸钠缓冲液中，并超速离心。在碳酸盐缓冲液中重复离心和重悬步骤至少三次，然后使用无菌MilliQ水进行最终重悬和离心步骤。将膜组分重悬于无菌去离子水中并冻干。
2.10. 膜蛋白分析
蛋白质组学由莱斯特大学蛋白质组学设施完成。使用过滤辅助样品制备方法进行膜蛋白的胰蛋白酶消化。使用RSLCnano HPLC系统和LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪进行LC-MS/MS。使用Proteome DiSCOVERER处理每个LC-MS/MS采集获得的原始数据文件，使用MASCOT针对UniProtKB-Swissprot数据库进行搜索。使用SCAFFOLD Q+S进一步处理Proteome DiSCOVERER的输出。对于定量实验，根据制造商的说明使用TMTsixplex标记试剂盒标记消化后的肽段。使用SCAFFOLD Q+对基于标记的定量肽段和蛋白质鉴定进行定量。质谱蛋白质组学数据已提交至ProteomeXchange Consortium。
2.11. 分析型凝胶过滤
将50微升浓度为50μM的PknB_PASTA在S75 10/300柱上以0.4毫升/分钟的流速进样。柱子用含有或不含25 mM MgSO4的25 mM Tris-HCl平衡。对于在不含MgSO4的缓冲液中的进样，将蛋白质与5 mM EDTA预孵育。在存在MgSO4的情况下进行凝胶过滤时，将蛋白质与25 mM MgSO4预孵育。
2.12. 核磁共振实验
所有核磁共振实验在20°C下在Bruker Avance III 700或Avance III 500光谱仪上进行，使用标准脉冲序列。NMR样品由约50μM 15N标记的蛋白质溶解在含有5% D2O的10 mM磷酸盐缓冲液中组成。