图 3、 D-丝氨酸抑制 CD8++T 细胞产生 IFN-γ。a, 在 BMDMs 中用或不用 D-丝氨酸(10 mM)处理(左)或用或不用 ATc 在 BMDMs 中处理 Rv0884c_cKDTet(右)的 H37Rv 胞内生存能力，使用 c.f.u. 实验评估。b, 在 BMDMs 中用或不用 ATc 处理的 Rv0884c_cKDTet的细菌活力，使用 LIVE/DEAD BacLight 细菌活力试剂盒检测。c,f, 用抗 CD3 和抗 CD28 抗体在 IL-2 和 IL-12 p70 存在下激活和分化幼稚 CD8+T 细胞 5 天，并用 PBS、D-丝氨酸或 l-丝氨酸处理。
检测了 CD8++T 细胞中 IFN-γ++(c)和 CD69++(f)的百分比。APC，别藻青蛋白。d,e, 野生型小鼠、Rag1−/−小鼠和过继转移了 CD8++T 细胞的 Rag1−/−小鼠(Rag1−/−+CD8)气溶胶感染约 200 c.f.u. 的指示 Mtb 菌株(d, 用或不用 ATc 的 Rv0884c_cKDTet、用 ATc 的 Rv0884c_cKDTet+Rv0884c(F108A)以及用 ATc 的 Rv0884c_cKDTet+Rv0884c；e, H37Rv)或用D-丝氨酸处理。感染后 4 周，使用 c.f.u. 实验测定肺组织中的细菌负荷。g, 将 H37Rv 感染的 BMDMs(MOI = 5)和经或不经D-丝氨酸处理的活化 TB10Rg3 T 细胞共培养 2 小时后，测量 TB10Rg3 T 细胞中 CD69+TB10Rg3 T 细胞的百分比。
h, 将 H37Rv 感染的 BMDMs(MOI = 5)和经或不经D-丝氨酸处理的活化 TB10Rg3 T 细胞共培养 3 天后，使用 ELISA 测量 IFN-γ 的表达。i, 感染 Mtb 菌株 1 天后，BMDMs 与经或不经 D-丝氨酸处理的活化 TB10Rg3 T 细胞共孵育 3 天，测定感染 1 天或 4 天的 BMDMs 中的胞内 c.f.u.。无 T，未用肽段刺激、感染 H37Rv 4 天且未与 T 细胞共孵育的 BMDMs 组；d1，未用肽段刺激、感染 H37Rv 1 天且未与 T 细胞共孵育的 BMDMs 组；d4，感染 H37Rv 4 天的 BMDMs 组；Rg3，用或不用肽段刺激、感染 H37Rv 4 天并与 TB10Rg3 T 细胞共孵育的 BMDMs 组。
j,k, C57BL/6 小鼠气溶胶感染约每只小鼠 200 c.f.u. 的 H37Rv 并给予 D-丝氨酸处理 4 周。测量了肺组织中 IFN-γ+(j)和 CD69+(k)CD8+T 细胞的百分比；FMO 用作对照。a–k 中的数据代表至少三个独立生物学重复的实验。结果以均值±标准差表示。使用 Tukey 多重比较检验的双因素方差分析(i)、Tukey 多重比较检验的单因素方差分析(c,d,f)和双尾非配对 Student t 检验(a,b,e,g,h,j,k)进行统计分析。
图 4 、 Rv0884c 抑制 CD8+T 细胞产生 IFN-γ。a, 将指示 Mtb 菌株感染的 BMDMs(MOI = 5)与活化的 TB10Rg3 T 细胞共培养 2 小时后，测量 TB10Rg3 T 细胞中 CD69⁺ TB10Rg3 T 细胞的百分比。b, 将指示 Mtb 菌株感染的 BMDMs(MOI = 5)与活化的 TB10Rg3 T 细胞共培养 3 天后，使用 ELISA 测量 IFN-γ 的表达。c, 感染 Mtb 菌株 1 天后，BMDMs 与活化的 TB10Rg3 T 细胞共孵育 3 天，测定感染 1 天或 4 天的 BMDMs 中的胞内 c.f.u.。d–g, C57BL/6 小鼠气溶胶感染约每只小鼠 200 c.f.u. 的 Rv0884c_cKD Tet(用或不用 ATc)、Rv0884c_cKD Tet 加 ATc 和 D-丝氨酸(30 g/l)、Rv0884c_cKD Tet+Rv0884c(F108A)加 ATc、以及 Rv0884c_cKD Tet+Rv0884c 加 ATc。
感染 4 周后，我们检测了：CD69⁺ CD8+T 细胞的百分比(d)；来自肺组织的CD8+T 细胞中CD8+ IFN-γ⁺ T 细胞的百分比(e)，或来自 dLNs 的 CD8+T 细胞中CD8+ IFN-γ⁺ T 细胞的百分比(f)；以及来自肺组织的CD8+T 细胞中 CD44high CD8+T 细胞的 CD69 MFI(g)。h, 用肽段(TB10.44-11)脉冲刺激的 BMDMs 感染用或不用 ATc 处理的 Rv0884c_cKD Tet 1 天，然后与来自 C57BL/6 小鼠或 Cd4CreIfngfl/fl 小鼠脾脏的体外分化的CD8+T 细胞共培养 3 天。感染 4 天后测量细菌负荷。i–k, Cd4CreIfngfl/fl 小鼠气溶胶感染约每只小鼠 200 c.f.u. 的 Rv0884c_cKD Tet(用或不用 ATc)4 周。通过 H&E 染色(i，上；比例尺，100 μm)、抗酸染色(j，下；比例尺，20 μm)、组织学评分(j)和细菌负荷(k)评估感染小鼠肺切片的组织病理学。
图 5 、Rv0884c/D-丝氨酸通过使 mTORC1 失活来抑制 CD8+T 细胞产生 IFN-γ。a,d,e，用抗 CD3 抗体、抗 CD28 抗体、IL-2 和 IL-12 p70 刺激幼稚 CD8+T 细胞 5 天，并用 PBS、D-丝氨酸或 l-丝氨酸处理。使用荧光激活细胞分选(FACS)分析 T-bet⁺ CD8+T 细胞的百分比(a)；检测了 S6K1 的磷酸化(d)，并使用 ImageJ 对 S6K1、p-S6K1 和 GAPDH 的水平进行定量，结果标示在印迹下方(d)；分析了溶酶体与 mTOR 的共定位(e；比例尺，2 μm)。b,c，C57BL/6 小鼠气溶胶感染指示的 Mtb 菌株。使用 FACS 分析了来自肺组织(b)和 dLNs(c)的CD8+T 细胞中 T-bet 的表达。
f，用抗 CD3 抗体、抗 CD28 抗体、IL-2 和 IL-12 p70 刺激幼稚 CD8+T 细胞 5 天，并用 PBS、D-丝氨酸或 mTORC1 抑制剂雷帕霉素处理。通过 FACS 检测了 IFN-γ(左组)和 T-bet(中组)的表达，并量化为CD8+T 细胞的百分比(右)。g,h，将感染 H37Rv(g)或指示 Mtb 菌株(h)1 天的 BMDMs 与经或不经 D-丝氨酸或雷帕霉素处理的 TB10Rg3 T 细胞共孵育 3 天。使用 ELISA 测量 IFN-γ 的表达。i,j，将感染 H37Rv(i)或指示 Mtb 菌株(j)1 天的 BMDMs 与经或不经 D-丝氨酸或雷帕霉素处理的 TB10Rg3 T 细胞共孵育 3 天。测定了 BMDMs 中的胞内 c.f.u.。k,l，在 IL-2 存在下，用抗 CD3 和抗 CD28 抗体刺激幼稚 CD8+T 细胞 24 小时，并用 PBS、D-丝氨酸或 l-丝氨酸处理。通过 Seahorse 代谢分析测量并分析了 ECAR(k)和 OCR(l)。
总结
适应低氧环境是结核分枝杆菌 （ Mtb ）在体内生存面临的主要挑战。产生干扰素（IFN）-γ的 CD8 + T 细胞有助于控制 Mtb 感染，部分原因是它们能够促进巨噬细胞的抗菌活性。然而 Mtb 是否会对抗这些反应，尤其是在低氧条件下，目前尚不清楚。本研究采用代谢组学、蛋白质组学和遗传学方法，发现 Mtb 能够诱导其磷酸丝氨酸氨基转移酶 Rv0884c（SerC）产生 D-丝氨酸。这种活性增强了 Mtb 在小鼠体内的致病性，但并不直接影响巨噬细胞内 Mtb 的存活。相反，D-丝氨酸抑制了 CD8 + T 细胞产生 IFN-γ，从而间接降低了巨噬细胞在共培养条件下限制 Mtb 的能力。
机制上，D-丝氨酸与 WDR24 相互作用，并抑制了 CD8 + T 细胞中 mTORC1 的激活。这导致 T-bet 表达降低，CD8 + T 细胞产生的 IFN-γ减少。我们的研究结果提示结核分枝杆菌存在一种逃避免疫的机制，即病原体对低氧环境的代谢适应导致氨基酸依赖性的抗结核适应性免疫抑制。
本研究发现了Mtb一种新颖的免疫逃逸策略：即通过缺氧诱导的代谢重编程（Rv0884c上调）产生D-丝氨酸，进而特异性抑制CD8+ T细胞的mTORC1-T-bet-IFN-γ轴功能，最终削弱宿主免疫力，促进细菌的持久感染。该发现将病原体的代谢适应与宿主T细胞功能抑制直接联系起来，为开发针对结核病的免疫干预策略提供了新的理论基础和潜在靶点。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在本研究中作为一个可靠的高通量平台，通过对细菌生长曲线的精确绘制，不仅验证了目标基因的基础功能，更重要的是揭示了D-丝氨酸在缺氧这一关键病理相关条件下对Mtb的独特作用，为连接细菌代谢适应与宿主免疫抑制两大过程提供了不可或缺的表型证据。