使用ChIP筛选BfmA调控的下游基因。BfmA-BfmK TCS的调节子以前从未被研究过。我们使用STRING数据库预测BfmA和BfmK可能的功能伙伴。根据基因组邻域、共现或不同物种中的基因融合事件的信息判断，BfmK和BfmA各自可能与10个蛋白质相互作用，这些蛋白质的得分很高（得分>0.850），其中三个是其他HK（Smlt0977[PhoR],RpfC[Smlt2234],和SmeS[Smlt4477]）。这些蛋白质中的六对，即PhoB-PhoR,Smlt1218-Smlt1219,Smlt1540-Smlt1541,Smlt3944-Smlt3949,SmeS-SmeR,和BfmA-BfmK，本身在基因组中成簇存在，表明与TCS BfmA-BfmK有很强的功能相关性。
由于BfmA是一个典型的OmpR家族RR，其C端具有一个转录因子（TF）区域（151至228个氨基酸）作为输出结构域，我们提出这些相关蛋白编码基因中的一些在转录水平上受BfmA直接调控。因此，通过DOOR数据库预测了这些相互作用蛋白编码基因的15个操纵子结构，并根据这些操纵子的预测启动子区域设计了PCR引物。然后使用ChIP结合半定量PCR来筛选可能与TF BfmA结合的DNA。
图5 BfmA调控其自身操纵子及Smlt0800的转录。(A) 通过染色质免疫沉淀(ChIP)技术筛选BfmA结合序列。细菌菌株在NYG培养基中培养至OD600值为0.4，采用ChIP收集BfmA结合的双链DNA。使用半定量PCR对与BfmA共沉淀的DNA量进行定量。No：未标记菌株(IFD-bfmA-bfmA)的ChIP DNA样本；His6：His6标记菌株(IFD-bfmA-bfmA*)的ChIP DNA样本；Sample：使用ChIP DNA进行PCR扩增；Input：使用ChIP前从细胞裂解液提取的细菌DNA进行PCR扩增（作为上样对照）。(B) 候选基因转录水平的半定量RT-PCR分析。cDNA使用嗜麦芽窄食单胞菌ATCC 13637的总RNA反转录合成。-RT表示阴性对照（cDNA合成过程中未加入反转录酶）。所有测试菌株均携带pBBRMCS2载体以确保可比性。实验独立重复三次。(C) 通过实时定量PCR检测BfmA调控基因的转录水平。以tmRNA扩增的cDNA作为内参。每个检测均采用生物学重复和技术重复三次。图示为代表性实验结果。竖线表示标准差。*表示经Student t检验计算的统计学显著差异(P<0.05)。
为进行此实验，我们构建了另一个bfmA互补菌株，类似于IFD-bfmA-bfmA菌株，但在bfmA序列的终止密码子5'区添加了一个His6表位标签编码序列。将该DNA插入片段克隆到pBBRMCS2载体中，用于互补bfmA突变体（菌株IFD-bfmA-bfmA）。使用针对BfmA-His6的单克隆抗体，基于该重组菌株（IFD-bfmA-bfmA）进行ChIP。如图5A所示，即使使用输入DNA样本作为DNA上样对照，PSmlt1216、PSmlt1423、PSmlt3944和PSmlt4477的启动子区域也未能通过PCR扩增，从而表明这些顺式调控序列中存在大量的遗传多态性。此外，PSmlt1436、PSmlt1540、PSmlt2233、PSmlt2700和PSmlt2801的PCR产物在样品中缺失，表明这些启动子不与BfmA结合。然后将上述九个启动子区域从后续分析中排除。然而，与使用来自缺乏His6标签的IFD-bfmA-bfmA对照菌株的共免疫沉淀DNA进行PCR扩增的背景对照相比，来自IFD-bfmA-bfmA*ChIP样品的PSmlt0570、PSmlt0800、PSmlt0978、PSmlt3568、PSmlt3949和PSmlt4209 PCR产物的量显著增加（图5A），表明BfmA-His6在体内直接结合这些启动子区域，并且相应的基因或操纵子受BfmA控制。
bfmA正向调控其自身操纵子和Smlt0800的转录
为了评估BfmA对其候选下游基因的调控效果，选择了其启动子区域可被BfmA结合的六个操纵子，并通过半定量RT-PCR比较了野生型菌株和IFD-bfmA突变体中mRNA的量。如图5B所示，未观察到代表性基因Smlt3949和Smlt3568的阳性扩增条带，表明在本研究使用的生长条件下它们的转录水平太低而无法检测到。Smlt0570和Smlt0978的mRNA量在测试的菌株中保持稳定（图5B），实时定量PCR也显示它们的mRNA水平在野生型菌株和bfmA突变体之间相似（见补充材料中的图S4）。这些结果表明，尽管存在TF-启动子结合事件，这两个基因的转录与BfmA的控制无关。Smlt0800和bfmK的转录水平在IFD-bfmA突变体中显著降低，而bfmA的遗传互补将其转录水平恢复至接近或高于野生型水平，表明BfmA作为正调控因子调节它们的表达。
为验证上述结果，采用实时定量PCR比较Smlt0800和bfmK的mRNA量。获得的结果与半定量RT-PCR分析的结果非常一致（图5C）；bfmA的框内缺失导致Smlt0800和bfmA的mRNA量分别减少60%和96%，并且这些减少几乎完全被突变体中bfmA的遗传互补所抑制（图5C）。总之，结果表明bfmA正向自动调节其自身操纵子的转录。此外，BfmA也是一个正调控因子，控制Smlt0800的转录，该基因编码一个参与酰基-CoA水解的酰基-CoA硫酯酶（命名为AcoT）。