土壤理化性质分析
土壤含水量的测定方法是将10 g土壤在105℃下烘干。使用pH计测定每个样本的pH值，土壤与去离子水的混合比例为1:2.5。土壤总有机碳含量使用自动元素分析仪（Vario TOC cube,Elementar,Germany）测定。土壤总氮含量使用自动凯氏定氮仪测定（NA1500，Fisons Instruments,Milano,Italy）。土壤总磷含量采用钼锑比色法测定。土壤总钾含量使用火焰光度法测定。土壤中的铵态氮和硝态氮浓度使用2 M KCl溶液浸提，土壤与溶液的比例为1:5。随后，分别使用靛酚蓝法和氯化钒分光光度法测定KCl提取液中的铵态氮和硝态氮浓度。碱性和酸性土壤中的有效磷含量分别采用Olsen法和Bray法测定。土壤质地使用激光粒度分析仪（LS-909,OMEC Instruments Co.,Ltd）测定。根据先前研究提出的标准，土壤颗粒分为黏粒（0~2μm）、粉粒（2~50μm）和砂粒（50~2000μm）。
土壤核酸提取
使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（Qiagen,Hilden,Germany）从0.50 g鲜土中提取总DNA。此外，分别使用碱性缓冲液洗涤、DNA酶消化和PMA处理提取土壤胞内DNA。除DNA外，使用RNeasy PowerSoil Total RNA试剂盒（Qiagen,Hilden,Germany）提取总RNA。我们使用总DNA作为参考，评估不同方法对土壤胞外和胞内DNA多样性分析的影响。碱性缓冲液洗涤方法按照已有方法进行。简而言之，将500μL PBS缓冲液（0.12 M；pH 7.4）和0.50 g新鲜土壤加入微量离心管中，水平摇动30 min（100 rpm）。随后，将悬浊液在7500×g下离心30 min（4℃），弃上清。重复此过程两次后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒提取残留土壤中的胞内DNA。PMA处理按照已有的方法进行，并稍作修改。PMA染料的浓度和处理时间基于先前研究优化，以确保有效去除胞外DNA。
具体而言，PMA溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，溶剂体积为500μL，最终PMA浓度为40μM。将该溶液加入0.50 g新鲜土壤中，混合物在室温下避光孵育5 min，并轻轻旋转。随后，将试管水平放置在冰盒上，并使用悬挂的650 W卤素灯在距离试管20 cm处进行四次连续的光暗循环，每次30 s。此后，将试管在10,000×g下离心2 min，弃上清。最后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒从残留土壤中提取胞内DNA。DNase预消化法按照最近研究的描述进行。反应混合物包括80μL DNase I（Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA）、805μL无核酸酶水、10μL MgCl2（1 M）、5μL牛血清白蛋白（10 mg/mL）、100μL Tris-HCl（0.5 M；pH=7.5）和0.50 g新鲜土壤。将试管在37℃下水平孵育60 min，摇动速度为100 rpm。随后，向每管加入50μL 0.5 M EDTA，并在75°C下孵育10 min以终止DNase反应。之后，将试管在12,000×g下离心20 min，弃去上清液。最后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒提取残留土壤中的胞内DNA。使用RNeasy Power Soil Total RNA试剂盒从2.0 g冷冻土壤中提取RNA，通过加入1μL DNase I（Qiagen,Hilden,Germany,10 U）、10μL 10×DNase Buffer去除90μL RNA提取物中的DNA残留。反应在37°C下孵育30 min以确保有效去除DNA。随后以总RNA作为模板，使用PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara BioInc.,Shiga,Japan）合成cDNA。反应体系包括16μL模板RNA、2μL dNTP Mixture（10 mM）和2μL随机六聚体（50μM）。在65°C下孵育5 min后，迅速冷却至冰上。随后，向反应体系中加入8μL 5×PrimeScript II Buffer、1μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、2μL PrimeScript I RTase（200 U/μL）和9μL无RNase水。最后，反应体系在30°C下孵育10 min，随后在42°C下孵育60 min，并在95°C下终止5 min。
qPCR和高通量测序
为定量原核生物16S rRNA基因拷贝数，我们使用LightCycler96实时PCR系统（Roche,Germany），使用的通用引物为515F（5′-GTG NCA GCM GCC GCG GTA A-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。在进行高通量测序时，使用相同的通用引物扩增16S rRNA基因。在土壤微生物群落分析中，最低序列数为50,000，而在模拟群落实验中，测序深度为35,000。所有详细的PCR条件和生物信息学分析程序见补充材料的方法部分。
土壤原核生物共现模式分析
原核生物共现网络分析仅包括出现频率高于50%（至少在一半样本中出现）且平均相对多度大于0.01%的ASV。选择此阈值是为了将分析重点放在采样中代表性较好的微生物类群上。使用R包WGCNA构建Spearman相关性矩阵，相关系数阈值为0.80，FDR调整后的p值<0.05，以保留共现网络分析中微生物类群之间的强相关性。使用“igraph”包计算网络属性，并使用Gephi进行可视化。通过计算自然连通性在移除不同比例节点时的变化来评估网络的鲁棒性。网络分析方法的详细描述，包括节点分类和生态学解释，见补充方法。土壤原核生物群落构建机制分析在本研究中，我们分别使用中性群落模型（NCM）、修正随机性比率（MST）和iCAMP模型来量化基于不同方法的土壤群落构建机制。更多方法细节见补充材料方法部分。
基于不同方法的土壤活体原核生物多度和多样性分析准确性评估
从上述52个土壤样本中选择了8个典型土壤，评估不同方法对土壤活体原核生物多度和多样性分析的准确性（图S14b）。这些土壤通过在121℃下高压灭菌30 min，随后在室温下孵育24 h进行灭菌。此过程重复三次以确保彻底灭菌。我们构建了一个由大肠杆菌Escherichia coli（革兰氏阴性，快速生长）、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens（革兰氏阴性，多功能）、脱氮副球菌Paracoccus denitrificans（革兰氏阴性，反硝化）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（革兰氏阳性，产孢子）和吸水链霉菌Paracoccus denitrificans（革兰氏阳性，丝状）组成的模拟群落，所有菌株均购自BNCC（BeNa Culture Collection）。这些菌株的详细信息见表S7。将模拟群落接种到每份灭菌土壤中，并立即提取总DNA、胞内DNA和RNA，具体操作如补充方法所述。我们使用总DNA作为活体原核生物群落的参考，因为模拟群落由活菌组成。灭菌土壤中可忽略的胞外DNA进一步支持总DNA作为活体原核生物群落的可靠标记。
随后，进行qPCR和高通量测序，以分别测定土壤原核生物的多度和多样性，具体如补充方法所述。鉴于接种菌株的序列在所有研究地点中占96%以上，我们随后的分析仅关注这5个菌株。
基于不同方法的土壤细胞外DNA去除效率测定
本研究选择了一份草地土壤和一份森林土壤，进一步评估了不同方法对土壤胞外DNA的去除效率（图S14c）。使用带标签引物的的16S rDNA模拟胞外DNA。简而言之，在标签引物在515F的5′端添加了19bp的人肌动蛋白序列（5′-CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′）。以从土壤样本中提取的DNA为模板，使用ACTF-515F和806R生成ACTF标记的16S rDNA PCR产物。PCR体系和参数如补充方法中的描述相同。使用GeneJET凝胶提取试剂盒（Thermo Scientific,Lithuania）纯化PCR产物，并使用Nanodrop2000（NanoDrop Technologies,USA）定量。随后，将ACTF标记的16S rDNA扩增子（源自每个土壤样本）以相当于该土壤总DNA含量50%的浓度添加到相应土壤中。
立即提取总DNA和胞内DNA，如前所述，每个样本四个重复。然后使用ACTF和806R通过qPCR测定DNA提取物中的ACTF-16S rDNA拷贝数。在原始土壤所提取的DNA中，基于ACTF和806R未观察到阳性扩增，这很大程度上确保了该方法的可靠性。最终，DNA去除效率计算为胞内DNA中ACTF标记的16S rDNA拷贝数与总DNA中ACTF标记的16S rDNA拷贝数的比值。在本部分实验中，同样选择总DNA作为参考，因为它可以提取添加到土壤中的所有被标记的胞外DNA，为比较不同方法去除胞外DNA的有效性提供了基准。
统计分析
本研究使用重复测量方差分析（RMANOVA）确定不同研究方法对土壤原核生物多度和多样性分析的影响。
使用Venn Diagram和UpSet R包识别和可视化了不同核酸提取方法表征的原核生物群落在ASV水平上共有和特有的ASV数量。使用非度量多维标度（NMDS）、主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估了不同研究方法对土壤原核生物群落结构的影响。使用Wilcoxon符号秩和检验确定不同活体原核生物研究方法对原核生物类群相对多度的影响，并使用Graphlan（http://gephi.github.io/）进一步可视化。类似方法也用于评估不同方法下活体和总体原核生物群落结构的差异。此外，计算了配对Bray-Curtis距离以进行进一步分析。使用geosphere包中的“distm”函数计算每对采样点之间的地理距离，然后基于Mantel检验分析了地理距离与群落组成相似性之间的关系。使用Mantel检验计算环境因素与原核生物群落结构之间的关系。使用结构方程模型探索环境因素与微生物群落之间的潜在因果关系。方法细节见补充材料方法部分。大多数统计分析在R（4.3.2）中进行。
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