摘要
抗生素的广泛使用正在选择多种耐药机制，严重挑战我们治疗细菌感染的能力。耐药细菌可以在治疗用的高抗生素浓度下被选择，但环境中存在的低得多抗生素浓度在选择中扮演的角色仍不清楚。本文通过高灵敏度竞争实验表明，耐药细菌的选择发生在极低抗生素浓度下。因此，对于三种临床重要抗生素，药物浓度低至敏感细菌最小抑制浓度的数百倍以下也能富集耐药细菌，即使其初始比例极低。我们还表明，新发突变体可以在抗生素的亚最小抑制浓度下被选择，并提供了一个数学模型预测此类突变体在敏感群体中接管的速度。这些结果为耐药性进化增添了新维度，并表明许多自然环境中存在的低抗生素浓度对细菌群体中耐药性的富集和维持至关重要。
引言
抗生素代表人类最重要的医学发明之一，但过去几十年中，抗生素耐药性的持续快速发展已成为社区和医院环境中最严重的医疗问题之一。尽管一些耐药基因最初很可能被选择用于代谢功能和/或信号传递或保护免受竞争性抗生素产生菌的侵害，但近年来微生物圈中高耐药病原菌的全球富集和传播很大程度上由人类活动驱动，包括在人类和兽医医学及农业中广泛使用和滥用抗生素。虽然很明显治疗用的高抗生素浓度可以选择耐药突变体，但低抗生素浓度——由于人为输入污染自然环境（如水体或土壤）、由抗生素产生微生物自然产生、或在治疗或促生长使用期间存在于某些人类/动物体腔室中——对耐药突变体的选择和富集的重要性仍不清楚。在药效学模型中，通常假设耐药细菌的选择仅发生在敏感野生型群体的最小抑制浓度和耐药细菌的最小抑制浓度之间的浓度范围内（突变体选择窗口假说，见图1A），且低于敏感最小抑制浓度的浓度不会抑制敏感细菌的生长，因此不具有选择性。早期对细菌敏感性微小差异的选择研究表明，选择可以高效作用于微小差异以选择耐药性。此外，一项近期研究使用巧妙的颜色测定法定性显示了低于最小抑制浓度的抗生素水平可以富集耐药细菌。本文进一步探索突变体选择窗口假说，并如图1A示意图所示，针对两种细菌物种和三种抗生素，研究预存和新发耐药突变体因敏感对应物生长速率的微小降低而能被选择性富集的浓度远低于敏感最小抑制浓度的程度。
为了确定暴露于极低抗生素浓度（远低于敏感最小抑制浓度）是否会导致耐药突变体富集，我们使用了几种明确定义的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌（变种Typhimurium LT2）突变体（文本S1中的表S1）以及三种对人类和兽医医学高度重要的抗生素类别（四环素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类）。使用的耐药标记包括Tn10dTet（赋予四环素耐药性）、gyrA(S83L和D87N)、ΔmarR和ΔacrR突变（赋予环丙沙星耐药性）以及rpsL(K42R)（赋予链霉素耐药性），这些均在多种细菌物种的临床分离株中发现。通过敏感和耐药同基因对之间的高灵敏度竞争实验，我们显示耐药细菌的选择可以发生在远低于最小抑制浓度的抗生素浓度下。最后，我们提出了一个数学模型，展示耐药突变体在这些亚最小抑制浓度抗生素水平下如何新发出现并传播。
材料与方法
细菌菌株、遗传方法和生长条件
本研究中使用的菌株衍生自大肠杆菌MG1655和鼠伤寒沙门氏菌LT2（文中指定为鼠伤寒沙门氏菌），列于文本S1中的表S1。耐药菌株通过P22转导（鼠伤寒沙门氏菌）或P1转导（大肠杆菌）将耐药基因转入亲本菌株构建。用于细菌生长的液体和固体培养基为Mueller-Hinton肉汤（Becton Dickinson,MD,USA）、Mueller-Hinton琼脂（Mueller-Hinton肉汤补充1.5%琼脂）和Luria-Bertani(LB)琼脂（Sigma-Aldrich,MO,USA）。菌株在37°C生长，液体培养通过振荡通气。
生长速率测量
生长速率在37°C Mueller-Hinton肉汤中测量，有四环素存在或无，使用Bioscreen C生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab Ltd,Helsinki,Finland）。每个孔接种过夜培养物的1000倍稀释液，每个抗生素浓度测量进行四次重复。培养物在连续振荡下生长24小时，每4分钟取OD600测量。计算基于0.02至0.1之间的OD600值，其中生长观察为指数期。敏感菌株(DA6192)和耐药菌株(DA17822)在单独实验中生长，相对生长速率计算为衍生生长速率除以同一菌株无抗生素生长时的生长速率。
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