讨论
双组分调控系统是广泛存在的原核信号转导系统，允许细胞响应不断变化的环境来调节其功能。尽管关于各种细菌物种中双组分系统的鉴定和表征的信息越来越多，但对其在变形链球菌（龋齿的主要病原菌）中的作用知之甚少。基因组分析揭示了几个相关革兰氏阳性生物（如肺炎链球菌、化脓性链球菌、芽孢杆菌属等）中存在许多推定的TCSTS。通过基因组分析，我们最近描述了变形链球菌中13个独立的TCSTS，并构建了编码这些系统的26个基因的25个单独突变体（Lau and Cvitkovitch,摘要）。由于我们的主要兴趣之一是鉴定参与变形链球菌毒力因子表达的TCSTS，我们专注于筛选与生物膜形成、酸耐受性以及其他环境应激（包括乙醇、月桂基硫酸钠（牙膏中常见）和H₂O₂）相关的突变体表型。
我们实验室先前的工作描述了一个由双组分调控系统（ComDE）组成的群体感应信号系统，该系统先前被证明影响变形链球菌的遗传感受态、生物膜形成和ATR。在本研究中，我们提供的证据表明，一个新的双组分调控系统HK/RR11在变形链球菌中作为生物膜形成和酸耐受性表型的决定因素起着重要作用。
我们的结果清楚地表明，删除hk11或rr11会导致形成生物量减少且具有海绵状结构的生物膜（图3和4）。通过SEM观察到一个显著特征是，与具有更连续外观的亲本生物膜相比，突变体生物膜似乎由许多大的细胞间通道组成。由于生物膜中的水通道促进了生物膜和主体液相之间的底物交换，因此hk/rr11突变体生物膜可能在运输底物或清除代谢终产物方面存在缺陷。
另一项由Bhagwhat等人进行的研究检查了六个TCSTS的应答调节蛋白缺陷的变形链球菌突变体。该研究中描述的一个突变体与RR11突变体（tceK）类似，并且也检测了其形成生物膜的能力。然而，Bhagwhat小组没有描述该突变体存在生物膜形成缺陷。值得注意的是，亲本菌株以及生长和测定条件与我们的不同。但是，我们关于rr11缺失不影响遗传感受态的观察与Bhagwhat等人的观察结果一致。然而，这些研究人员确实发现，失活tcbR（编码ComD/ComE TCSTS的应答调节蛋白的comE基因）导致生物膜形成减少10倍，这与我们之前的发现一致，即comD和comE突变体形成有缺陷的生物膜，且生物量减少。
与亲本菌株相比，SMHK11和SMRR11生物膜都具有海绵状结构，由组织成非常长链的细胞组成，这是我们之前在使用无法产生信号肽信息素CSP的comC突变体形成的生物膜中观察到的特征。然而，有缺陷的comD或comE突变体并不具有网状或海绵状结构，这表明存在一个单独的途径对CSP有反应。为了进一步支持第二个CSP传感器系统的存在，我们发现外源添加CSP或用野生型comC基因补充comC突变体可部分恢复comCDE突变体生物膜的野生型表型。由于该突变体在产生CSP及其同源受体（由comD编码）方面存在缺陷，我们假设存在另一个识别CSP并参与细胞分裂或分离的受体，最终影响生物膜结构。
由于我们怀疑由hk/rr11编码的TCSTS可能作为第二条途径起作用，我们向突变体培养物中添加CSP，以评估对hk11和rr11突变体生物膜细胞链形成的影响。结果显示，向突变体培养物中添加CSP对组成突变体生物膜的链长度没有可观察到的影响（数据未显示）。这一结果与HK11作为CSP受体的作用一致，但并未提供直接证据来最终确定HK11作为CSP受体的作用。有必要对CSP与hk/rr11系统的相互作用进行更仔细的研究。
Wen和Burne最近描述了一个基因，命名为brpA（生物膜调节蛋白），它编码变形链球菌UA159中的一个406个氨基酸的蛋白质。他们的工作还表明，brpA的失活导致产生异常生物膜的菌株，该突变体形成的链比亲本菌株更长。尽管这里清楚地观察到了相同的表型，但目前没有数据将BrpA介导的效应与HK/RR11系统联系起来。未来的研究将有必要检查HK/RR11系统、brpA和comCDE群体感应系统之间可能的相互作用。
由于我们怀疑hk/rr11基因可能编码一个肽感应系统，我们搜索了该区域是否存在编码包含潜在双GG切割位点（分泌信号肽的典型特征）的小ORF，但未能鉴定出任何候选基因。周围基因的推定功能并不暗示它们在遗传感受态、生物膜形成或酸耐受性中具有明显作用。尽管这些邻近基因在当前与CSP反应相关的表型中似乎没有明显作用，但它们可能有助于在生物膜或高细胞密度环境中的最佳存在。例如，最近证明肺炎链球菌中编码丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的pflC基因被肺炎链球菌CSP系统激活，而该基因与遗传感受态没有明显关系。编码丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的pflC基因与hk/rr11基因非常接近；研究这些基因之间的联系将会很有趣，因为在变形链球菌中，丙酮酸甲酸裂解酶对氧极度敏感，并且可能在厌氧生物膜中的高细胞密度下发挥最佳功能。
另一个有趣的观察是，hk11突变体（SMHK11）在酸耐受性方面显著受损。SMHK11在低pH下的生长和适应信号pH（pH 5.5）后对酸杀灭的抵抗力方面都存在缺陷。这表明由hk11编码的膜相关蛋白可能作为pH传感器，参与激活据信影响变形链球菌酸耐受表型的众多途径之一。已有研究表明TCSTS可作为pH传感器：最著名的是根瘤菌的actSR和单核细胞增生李斯特菌的lisRK，它们对于诱导适应性ATR至关重要。有趣的是，只有SMHK11表现出酸敏感性，因为我们在删除rr11基因时没有观察到相同的表型效应。直观上，人们会期望编码TCSTS的任一基因的失活或缺失都会产生相似的表型，因为组氨酸激酶受体或其同源应答调节蛋白的缺陷可能会阻碍输入信号激活由应答调节蛋白控制的基因和途径。然而，在我们的研究中，SMHK11和SMRR11具有不同表型的观察结果表明，相关受体之间可能存在交叉对话，其中hk/rr11系统的组氨酸激酶传感器蛋白可以将pH信号传递给一个或多个非同源应答调节蛋白。这种现象称为体内交叉对话，最近由Verhamme等人描述，他们通过体内方法证明了大肠杆菌中四个关键双组分系统之间的相互作用。他们的结果表明，传感器激酶的功能性组氨酸磷酸转移结构域似乎是生理交叉对话中的积极参与者。需要进一步的研究来鉴定在SMRR11中通过HK11传感器蛋白发生的交叉对话中涉及的推定应答调节蛋白。
SMHK11和NG8的2D图谱比较显示，14个酸诱导（和抑制）蛋白质在突变体和亲本之间是保守的（表3）。然而，SMHK11有四个在NG8中可见的蛋白质在突变体中未检测到。其中之一，1008号蛋白质，可能是组氨酸激酶HK11本身，其在30 kDa处迁移，pI为5.5。从HK11的推导蛋白质序列获得的值如下：计算分子量为38,113 Da，估计pI为5.71。另一个在SMHK11中未被诱导的有趣蛋白质是87号点，它代表一种外切多磷酸酶。多磷酸代谢已与许多细菌（包括变形链球菌）的生物膜形成相关联。多磷酸可能提供了应对生物膜生长过程中遇到的环境波动所需的快速能源。
在rr11的5'端附近鉴定出与肺炎链球菌的com-box惊人相似的启动子样结构是引人入胜的。在CSP限制和诱导条件下研究rr11的表达可能有助于破译变形链球菌的com-box。我们已经在变形链球菌基因组中发现的晚期感受态直系同源物附近鉴定出了类似的结构。推导变形链球菌的com-box可能加快我们解开这个调节子的速度，因为它将允许我们通过计算机分析鉴定候选基因。对CSP介导的及其他参与生物膜表型表达的基因的理解将有望使我们发现控制问题生物膜的方法。
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