酶谱法
使用含有共聚酪蛋白的8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶对藤黄微球菌B1pz浓缩培养液进行酶谱分析，揭示了三个活性条带的存在（图5）。每种肽酶都表现出高分子量，分别为229 kDa、185 kDa和139 kDa。明胶酶谱法暴露了一个额外的62 kDa活性条带。
羽毛肉汤培养基中生长期间硫化合物的积累
已知角蛋白底物的微生物利用受到化学或酶学因子还原潜力的支持。在培养条件下羽毛的降解和富含半胱氨酸的羽毛角蛋白的水解导致不同氧化水平的硫化合物积累（图6）。主要的硫形式是硫酸盐，达到7.8 mM的水平，高于培养基组成中最初存在的浓度，其峰值出现在培养的第7天，紧随角蛋白酶最大生产期之后。也检测到显著存在的亚硫酸盐，浓度低一倍，其释放呈持续增加趋势。还原性硫醇和硫代硫酸盐的浓度保持在相对较低的水平，但在整个培养过程中累积到接近0.1 mM的水平。
二硫键还原酶活性
二硫键还原酶活性可能是在细菌生长过程中支持角蛋白底物中二硫键蛋白水解断裂的一个因子。在本实验中，在培养第4天的上清液中未检测到二硫键还原酶活性，而此时积累的硫醇和角蛋白分解活性水平最高。然而，在细胞匀浆部分中测定出5.40 U的活性。上清液离心后，活性下降至仅0.32 U，暗示所测试的酶具有膜结合性质（数据未显示）。
存在还原性硫化合物情况下的细菌生长和角蛋白酶生产
还原剂无疑在微生物角蛋白分解中起作用，因此，分析了在培养环境或反应混合物中引入额外还原剂的可行性。在标准营养肉汤的微培养中，浓度为0.5-1 mM的半胱氨酸对最大比生长速率以及最大生物量产量影响很小。相反，1-5 mM的2-巯基乙醇或每种化合物在5 mM浓度下显著损害细胞生长。。1 mM好的，我们继续翻译文档剩余的部分。
亚硫酸盐和1 mM的二硫苏糖醇，尽管延长了延滞期并轻微恶化了生长速率，但并未严重降低菌株的生物量生产（表3）。在补充了1 mM选定还原剂的羽毛培养基中进行烧瓶培养，对角蛋白酶和蛋白酶生产的分析揭示了不同的效果（图7）。蛋白水解活性水平在亚硫酸盐、二硫苏糖醇，尤其是半胱氨酸存在的情况下均显著降低。角蛋白酶的生产也受到亚硫酸盐和二硫苏糖醇的负面影响，然而，添加半胱氨酸导致角蛋白分解活性增加了50%。尽管如此，在给定浓度下，没有一种化合物能增强羽毛的降解。
| 还原剂 | 延滞期[h] | μmax[h?1] | ODmax |
| 对照 | 2 | 0.198 | 1.868 |
| 半胱氨酸 | 2.5 | 0.132 | 1.764 |
| 亚硫酸盐 | 3 | 0.084 | 1.619 |
| 二硫苏糖醇 | 6 | 0.097 | 1.694 |
| 谷胱甘肽 | 3 | 0.180 | 1.533 |
| 2-巯基乙醇 | 3 | 0.095 | 1.648 |
表3-藤黄微球菌B1pz在存在还原剂（1 mM）的营养肉汤上的生长情况。
还原性硫化合物对粗培养液中角蛋白酶在天然羽毛上活性的影响
在涉及藤黄微球菌B1pz无细胞粗培养液的对天然羽毛的反应过程中，观察到了额外还原因子的明显积极效果（图8）。1 mM半胱氨酸的存在导致角蛋白分解活性提高了125%，其次是二硫苏糖醇和2-巯基乙醇，而亚硫酸盐则对角蛋白水解产生负面影响。
讨论
一种从禽类羽毛废弃物中分离的蛋白酶生产菌，经系统发育鉴定为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）物种的成员，并对其角蛋白分解潜力进行了探究。其有效降解羽毛角蛋白的能力得到证实，并揭示了所产角蛋白酶总体活性高于酪蛋白分解蛋白酶的罕见特性。最高的角蛋白酶生产发生在存在1-2%羽毛角蛋白以及添加培养基补充剂如酵母提取物或蛋白胨的情况下，这一点至关重要。这与关于多种角蛋白降解放线菌和其他细菌（包括芽孢杆菌属）的大多数报告相符。通常需要少量蛋白质补充剂来支持在难降解角蛋白上的初始生长，并且增加角蛋白底物浓度会对生长和角蛋白酶生产产生不利条件。然而，重要的是，藤黄微球菌B1pz即使在羽毛作为唯一营养源的培养基中也能进行适度生长和酶生物合成，这验证了其角蛋白分解的特性。此外，蛋白酶生产动态与玫瑰色库克菌（Kocuria rosea）相当。该菌株的角蛋白分解潜力也在各种角蛋白附属物上进行的短暂4天培养中进行了测试。藤黄微球菌的水解作用主要针对禽类羽毛或表皮角质层的"软"角蛋白，而不是其他"硬"角蛋白。毛发型附属物由于其极其坚韧的结构，仍然不易被生物降解，但仍然是有效的角蛋白酶诱导物。
藤黄微球菌B1pz的角蛋白分解和蛋白水解酶似乎是主要为丝氨酸和硫醇蛋白酶的混合物，具有总体碱性最适条件。这类似于来自微球菌科的玫瑰色库克菌的情况，其产生的角蛋白酶对EDTA较不敏感。酶谱分析揭示了两个主要活性条带的存在，分别为90 kDa和超过200 kDa，这与藤黄微球菌B1pz获得的结果相关，显示了一个62 kDa的低分子量蛋白酶部分和另外三个高于139 kDa的蛋白酶。对玫瑰色库克菌角蛋白酶的进一步纯化使得能够展示一种240 kDa的酶，其在40°C和pH 10下具有最佳活性。绝大多数细菌角蛋白酶属于低分子量丝氨酸蛋白酶。通常，蛋白水解酶的高分子量仅限于同多聚体结构，例如海岛炽热杆菌（Fervidobacterium islandicum）中由97 kDa亚基组成的>200 kDa角蛋白酶复合物，或超嗜热海床热袍菌（Thermotoga maritima）中由31 kDa亚基组成的>669 kDa复合物，然而玫瑰色库克菌的角蛋白酶仍然是一个单一的蛋白质部分。
人们提出了不同的机制来解释角蛋白的微生物分解，其中在蛋白水解分解之前断裂二硫键是固有的。一种模式基于胱氨酸的亚硫酸裂解，通过细胞作为从角蛋白衍生的过量硫而排泄的亚硫酸盐进行。这主要在角蛋白分解丝状真菌和放线菌中描述，但在一些细菌中也是可能的。另一种模式涉及通过特定的还原酶样酶进行直接还原，导致还原性硫醇的积累，这已在几种细菌菌株中得到证实。
微生物分离株的角蛋白分解潜力通常从生长环境中的角蛋白分解和角蛋白酶对角蛋白底物的活性两方面来考虑。生长环境中还原因子的存在常常被讨论为角蛋白利用中的一个影响因素。对于测试的藤黄微球菌，在羽毛培养基中生长时，证实了二硫键还原酶活性的存在，但主要存在于细胞匀浆部分中，而不是在培养液中。还原酶的膜结合位置是最典型的，正如Bockle和Moller针对S.pactum或Ramnani等人针对地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）所强调的那样。然而，Yamamura等人和Prakash等人分别针对嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas sp.）和耐盐芽孢杆菌（B.halodurans）的报告，证明了在羽毛肉汤培养期间存在细胞外二硫键还原酶。藤黄微球菌在羽毛培养基中的培养物也测试了硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫醇的水平。硫酸盐作为硫排泄的最氧化形式，以最高浓度产生，然而这种化合物在亚硫酸裂解中不起作用。相比之下，亚硫酸盐作为硫酸盐的代谢前体，在整个15天的培养过程中累积到0.8 mM的水平，已知是二硫键还原的重要支持。Cedrola等人报告了在羽毛培养基中地衣芽孢杆菌SLC的8天培养物中亚硫酸盐水平略有降低（0.15 mM），而Ramnani等人证实了地衣芽孢杆菌RG1培养物中亚硫酸盐的存在。
还原性硫化合物即使在低浓度下也可能对细胞代谢有害，因此，测试了这些组分补充对细胞生长和角蛋白酶生产的影响。使用Bioscreen C对无羽毛营养肉汤中的微培养进行分析，证实了大多数硫化合物的抑制作用，然而在1 mM浓度下，抑制水平是适度的，因此可以接受用于进一步探究。因此，将选定的还原化合物在1 mM浓度下：亚硫酸盐、半胱氨酸和二硫苏糖醇引入含有羽毛的培养基中。只有半胱氨酸刺激了角蛋白酶的生产，但这可能部分是由于以较低的蛋白水解活性为代价的酶激活所致。其余试剂导致角蛋白酶和蛋白酶生物合成的显著损害，同时伴随着羽毛利用率的降低，从而得出结论：与还原剂对微生物细胞的有害影响相比，底物中的亚硫酸裂解程度是无效的。同样，Cedrola等人（2012）通过向地衣芽孢杆菌培养物中添加0.1-1%的亚硫酸盐，实现了明胶酶的刺激，但不是角蛋白酶的生产，并且羽毛降解略有增加。
此外，在涉及无细胞粗培养液的对天然羽毛的酶促反应中测试了还原化合物的效果。角蛋白分解活性的显著增强主要在半胱氨酸存在下实现，其次是二硫苏糖醇和2-巯基乙醇，这是由于亚硫酸裂解效应或蛋白酶激活。在几个报告中发现了无细胞角蛋白酶对角蛋白水解的类似刺激，通常被认为是完全底物降解的必要条件。为了在缺乏微生物细胞氧化还原系统的情况下实现有效的角蛋白水解，角蛋白酶的蛋白水解作用需要二硫键还原化合物的支持。还原环境为角蛋白水解创造了有利条件，即使使用常规的、非角蛋白分解的蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶、Savinase、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶。
由于藤黄微球菌B1pz菌株的初步表征证实了其角蛋白分解潜力，主要是针对生羽毛，因此需要进一步研究以探究特定的蛋白酶和酶生产的详细条件。尽管如此，所展示的分离株在禽类副产品的生物降解或作为蛋白质饲料成分的角蛋白质量价值改性方面都具有可行的应用能力。
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