DNA芯片分析
转录组研究使用恶臭假单胞菌芯片；该芯片包含5539个基因特异性寡核苷酸（50聚体），一式两份点样到γ-氨基硅烷处理的25×75 mm显微镜载玻片上，并通过紫外线和加热固定。将恶臭假单胞菌DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28在LB培养基中过夜培养，用于接种含或不含300μM吲哚的新鲜培养基；培养物在30°C孵育至660 nm处浊度达到0.5-0.6（指数期），收集细胞并立即进行RNA提取。使用TRI试剂（Trizol）/BCP（1-溴-3-氯丙烷）法分离RNA，随后制备荧光标记的cDNA；杂交条件和数据收集按先前描述进行。采用LOWESS强度依赖性归一化方法对数据进行归一化，使用Almazen系统软件进行统计分析；采用学生t检验计算P值，当倍数变化≥2且P值≤0.05时，认为基因差异表达。芯片数据已存入Array Express数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress），登录号为E-MEXP-3819、3822、3823和3824。
流式细胞术HPF荧光实验
使用5μM荧光报告染料HPF，PMT（光电倍增管）电压设置如下：E00（FSC）、360（SSC）和825（FL1）；使用FACSDiva 6.0软件处理和分析流式数据。所有实验中，细胞过夜培养后以1:1000稀释到25 mL含5μM HPF的LB培养基中，烧瓶在避光摇床中30°C、200转/分钟孵育；在指数生长期早期添加抗生素（详见结果部分），在添加药物前（0时刻）和3小时后取样；在这些时间点收集约10^7个细胞，洗涤一次并重悬于过滤后的PBS（pH 7.2）中，然后进行荧光测量。
Bioscreen生长曲线分析
从添加10μg/mL利福平的LB平板上挑取新鲜培养的恶臭假单胞菌DOT-T1E和DOT-T1E-18单菌落，在液体LB培养基中30°C过夜培养；将培养物重悬于15 mL液体LB培养基中，调整至660 nm处吸光度为0.1。在微孔板的每个孔中加入190μL液体LB培养基或170μL大肠杆菌LK111过滤上清液（均添加200μg/mL氨苄西林），以及10μL重悬培养物；对于大肠杆菌上清液，添加20μL 10×LB培养基。阳性对照孔为接种DOT-T1E菌株的液体LB培养基，阴性对照孔为不含细胞的培养基。使用FP-1100-C型Bioscreen C MBR分析仪系统在30°C连续振荡条件下监测生长；在24小时内，每60分钟使用420-580 nm边带滤光片测量浊度。每个菌株对每种测试化合物至少进行三次实验，每次实验后目视检查平板以验证结果。
实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）
RNA提取按先前描述进行，实时PCR扩增在MyiQ2系统上进行，结合iQ5光学系统软件（版本2.1.97.1001）。每个25μL反应混合物包含12.5μL iQ SYBR绿色超混合液[100 mM KCl、40 mM Tris-HCl（pH 8.4）、0.4μM每种dNTP、iTaq DNA聚合酶（50 U/mL）、6 mM MgCl2、SYBR绿色I、20 nM荧光素和稳定剂]、0.4μM每种引物和2μL模板cDNA（稀释10倍或1000倍）。热循环条件如下：95°C 10分钟（1个循环），然后95°C 15秒、61.1°C或61.7°C（分别用于吲哚和氨苄西林实验）30秒、72°C 20秒（40个循环），每个循环进行一次荧光测量（按制造商建议）；最后进行72°C 1分钟的延伸循环。PCR产物长度在132-350 bp之间；熔解曲线分析通过将PCR混合物从55°C逐步加热至95°C（每10秒升温0.5°C，共80个循环）进行。基因的相对表达水平以16S rRNA为内参基因进行归一化，结果采用比较阈值循环（ΔΔCt）法分析。
结果
利用荧光染料分析恶臭假单胞菌对抗生素的响应
在恶臭假单胞菌DOT-T1E菌株中，某些杀菌化合物（氨苄西林、诺氟沙星）和抑菌化合物（氯霉素、四环素、红霉素）的主要排出机制是通过RND外排泵实现的。本研究监测了野生型恶臭假单胞菌DOT-T1E及其ttgABC敲除突变体（T1E18）、ttgGHI敲除突变体（T1E-PS28）和双突变体ttgABC/ttgGHI（T1E-PS32）（表1）在暴露于氨苄西林、诺氟沙星（杀菌化合物）以及氯霉素、红霉素、四环素（抑菌抗生素）后的细胞生长停滞、细胞死亡和3'-对羟基苯基荧光素（HPF）荧光淬灭情况。
首先，我们测定了四种菌株对上述五种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。结果显示，T1E-PS28的MIC与野生型DOT-T1E一致（表2），而两种TtgABC缺陷菌株（T1E-18和T1E-PS32）对抗生素的敏感性显著提高（表2）。对于抑菌化合物，300μg/mL氯霉素、400μg/mL红霉素或8μg/mL四环素可抑制野生型菌株生长，但在整个实验过程中（3小时）细胞存活率保持100%（氯霉素的结果见图1A）；对于TtgABC突变体，70μg/mL氯霉素即可抑制生长，而双突变体在更低浓度下生长就会受到抑制（表2），但实验过程中细胞仍存活。
对于杀菌化合物，这类抗生素首先抑制细胞生长，3小时后由于细胞裂解，存活细胞数量减少两个数量级。亲本菌株DOT-T1E和PS28菌株在625μg/mL氨苄西林或2μg/mL诺氟沙星作用下表现出上述效应；T1E-18和T1E-PS32在更低浓度的这两种杀菌化合物作用下即可停止生长，随后发生细胞死亡。
吲哚是TtgV的效应物，而TtgV是调控ttgGHI表达的抑制子。我们推测，由于TtgGHI泵参与抗生素排出，吲哚存在时恶臭假单胞菌DOT-T1E的抗生素耐药性可能增强。我们在有吲哚存在的条件下，对亲本菌株及ttgABC、ttgGHI和ttgABC/ttgGHI突变体重复了MIC实验（见表2）。结果显示，DOT-T1E和T1E-PS28（ttgGHI突变体）在有无吲哚存在时的抗生素耐药模式相似，无显著差异（表2）；T1E-PS32双突变体在有无吲哚存在时均比亲本菌株对抗生素的耐药性更低；而T1E-18菌株在吲哚存在时表现出更强的抗生素耐药性，这表明在缺乏TtgABC的情况下，吲哚依赖性TtgGHI诱导对耐药性具有重要作用。
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