ET菌株的基因组测序和变异分析。使用Sigma GenElute细菌基因组DNA试剂盒（NA2110）从4-ml ET菌株培养物中提取总共12μg基因组DNA。DNA在Illumina MiSeq仪器上测序，插入片段大小为795 bp，300 bp双端读长。总共有5,077,282条读长通过Picard Tools（https://github.com/broadinstitute/picard）的质量过滤和比对，产生约250倍基因组覆盖度。相对于参考菌株基因组（NCBI登录号NC_010001.1），ET基因组中的序列变异（单核苷酸多态性[SNPs]和插入缺失）使用基因组分析工具包（GATK）（20）进行识别。
ADH纯化和活性测量。将来自野生型（WT）和ET菌株的Cphy3925编码基因通过连接无关克隆（21）克隆到pET-22B(+)中，如前所述（19）。使用引物对cphy3925F/cphy3925R（表1）克隆带有C末端His标签的基因，并通过测序确认。将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)（Novagen 70235）中，在50 ml TB培养基（12 g liter-1胰蛋白胨，24 g liter-1酵母提取物，4 ml liter-1甘油）中生长至OD600为1，通过添加500μM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）并在20°C孵育过夜诱导表达。细胞沉淀，重悬于裂解缓冲液（50 mM磷酸缓冲液[pH 8]，0.5 M NaCl，10 mM咪唑，15%甘油，1 mM Pefabloc[Sigma 76307]），并通过超声处理（Cole-Parmer Vibracell CV33）与溶菌酶（Novagen 71230）裂解。从50 ml培养物中在镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）离心柱（Qiagen 31014）上纯化His标签蛋白，并在12%SDS-PAGE凝胶（Novex 12%Bis-Tris gel NP0342BOX）上可视化。酶活性如参考文献22所述在100μl 100 mM Tris-HCl(pH 8)中测量，含有辅因子[0.2 mM NADH(P)H或2 mM NAD(P)+]和适当底物（300μM乙酰辅酶A[acetyl-CoA]或CoA，18 mM乙醛，2 M乙醇）。NAD(P)H在室温下使用SAFAS UVmc2分光光度计测量340 nm吸光度（消光系数6.22 mM-1·cm-1）。
质粒构建和转化。pQexpE衍生自pQexp（23），这是一种在大肠杆菌（200μg ml-1红霉素）和C.phytofermentans（平板上40μg ml-1红霉素，液体培养中200μg ml-1红霉素）中稳定复制并带有红霉素选择性的质粒。为了构建pQexpE，使用引物对pdcAdhB_F/pdcAdhB_R（表1）从pES120（24）PCR扩增Z.mobilis的pdc和adhB基因，并克隆到pQexp的独特BamHI和PvuI位点。使用引物对pQexp_F/pQexp_R通过测序确认插入。pQexpE通过供体菌大肠杆菌S17-1接合转移至C.phytofermentans。接合操作如参考文献23和25所述，不同之处是使用聚醚砜膜支持50-μl培养物混合物，并且在交配后仅使用萘啶酸（不含甲氧苄啶）来选择对抗大肠杆菌。通过使用引物对pQexp_F/pQexp_R进行菌落PCR扩增2.9-kb的pdc-adhB操纵子，确认含有pQexpE的阳性C.phytofermentans转接合子。
核苷酸序列登录号。ET基因组的FASTQ格式DNA测序文件已提交至欧洲核苷酸档案库，主要登录号为PRJEB7255。
结果与讨论
乙醇耐受性C.phytofermentans菌株的分离与生理学。在补充了0、2、4、6或7%（体积/体积）乙醇的培养物中监测野生型（WT）C.phytofermentans的生长（图1A），并计算了代时（小时）和最大细胞密度（OD600）。WT菌株培养物在0%乙醇和2%乙醇中生长相似，但在4%乙醇中生长显著抑制，在6%和7%乙醇中几乎观察不到生长。相比之下，ET菌株在4%、6%和7%乙醇中生长，在7%乙醇中的最大细胞密度（OD600）与WT菌株在4%乙醇中的相似。
虽然ET菌株更耐乙醇，但它在不添加乙醇的培养物中比WT菌株生长更慢，并且细胞产量降低（图1）。ET菌株的葡萄糖消耗也慢于WT菌株，反映了降低的生长速率。当在30 g liter-1葡萄糖上生长时，ET菌株在200小时内仅消耗20 g liter-1底物，而WT菌株在不到150小时内完全耗尽葡萄糖。因此，ET菌株在高乙醇浓度下增强的生长伴随着标准条件下生长的减少，支持了ET菌株具有改变生理学的观点，与适应5%乙醇的C.thermocellum结果相似（26,27）。然而，我们未观察到在GS2琼脂平板上生长的ET和WT菌落或在液体GS2培养基中生长的细胞之间存在形态学差异。
ET菌株每单位糖消耗产生的乙醇也少于WT菌株。例如，当在纤维素、纤维二糖和葡萄糖上生长时，ET菌株的乙醇产量（每摩尔葡萄糖当量消耗产生的产物摩尔数）相对于WT菌株降低了25%至50%（图2A），而菌株的乙酸产量相似（图2B）。我们还测量了在补充了0、3.75或7%乙醇的纤维二糖培养基中生长的WT和ET培养物的纤维二糖消耗以及主要发酵产物乙醇、乙酸和甲酸的形成（图2C）。WT菌株的乙醇产量在3.75%乙醇时显著降低，并且在7%乙醇时纤维二糖消耗和发酵停止。相比之下，ET菌株的纤维二糖消耗和乙醇产量仅随乙醇补充量的增加而轻微下降，证明了乙醇抗性表型的稳健性。总之，这些结果突出了ET菌株在高乙醇浓度下代谢和产生乙醇的表型优势，但也表明这些优势是以在低环境乙醇浓度下较低的乙醇产量和较慢的生长为代价的。
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