摘要：减毒沙门氏菌VNP20009具有较好的在肿瘤中定殖、复制并发挥一定抗肿瘤作用的特性，可作为抗癌药物载体或与其他疗法（如化疗）联用，具有较好应用前景。本文对VNP20009的生物学性质进行研究，检测了VNP20009在不同温度、pH值及H₂O₂作用下的生长曲线及细菌生物膜的形成。结果表明，VNP20009在42 ℃、弱酸性环境pH 6.5以及H₂O₂（1 mmol·L⁻¹）条件下可正常生长，弱酸性环境有益于VNP20009生物膜的形成。本实验结果对深入研究减毒沙门氏菌的生存机制和应用提供了基础。
减毒型沙门氏菌VNP20009被用来抗肿瘤已被多篇文献报道，其不仅可利用自身毒性抗肿瘤，还可作为载体携带质粒和小发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）。通过VNP20009所携带的质粒表达的外源蛋白［例如内皮抑素（endostain）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）和C末端截短型Fas相关死亡域蛋白（C-terminal tail Fas associated via death domain, N-FADD）等］具有很好抗肿瘤作用。除了在动物模型上验证到良好的抗肿瘤作用外，VNP20009已作为抗癌药物进行了临床Ⅰ期的验证。目前围绕VNP20009的研究主要集中于抗肿瘤活性药效学，其微生物学特点未被仔细研究，将妨碍人们对该菌株特性的深入认识和了解，并将限制其应用和转化。为了更好利用VNP20009，对其进行基础生物学研究是必要的。
细菌生物膜是细菌聚集后形成的黏稠状结构，该结构可形成自我保护机制，保护细菌免受外界环境影响。细菌生物膜由细菌、多糖以及细菌分泌物组成，生物膜中的细菌一般不受环境压力、抗生素、消毒剂和宿主免疫系统的影响。因此细菌生物膜的形成情况与细菌抵御被清除有着密切关系。
本文研究了沙门氏菌VNP20009在不同环境条件（温度、pH值和不同浓度H₂O₂）的生长状况以及生物膜的形成，为VNP20009的深入研究及其应用奠定基础和提供理论依据。
材料与方法
试剂与仪器：酵母提取物和胰蛋白胨（Oxoid公司）；M63培养基缓冲液（合肥博美生物科技公司）；酶标仪（美国Bio Tek公司）、pH仪（瑞士METILER TOLEDO公司）、恒温摇床（上海知楚仪有限公司）、细菌培养箱（德国MEMMERT公司）。
菌株及生长条件：沙门氏菌VNP20009由本实验室保种。将保存于20%甘油（-80 ℃）的菌种在无抗生素的LB（Luria-Bertani）琼脂培养基（1%蛋白胨、1% NaCl、0.5%酵母膏和1.5%琼脂粉，高压灭菌）进行过夜活化，挑选单克隆菌接种于LB液体培养基过夜培养后，按1∶100比例接种于LB培养基，37 ℃、220 r·min⁻¹培养至对数生长期（A₆₀₀：0.6～0.8），作为样品菌备用。评价VNP20009在3种条件下的生长及细菌生物膜形成：①温度（37、42和45 ℃）；②pH值（7.0、5.0、6.5和8.5）；③H₂O₂（0、1、1.5、2、2.5和5 mmol·L⁻¹）。
细菌生长曲线的测量：使用酶标仪连续24 h检测不同条件下VNP20009的生长曲线。将样品菌按1%接种量接种于不同条件（pH值、H₂O₂）的LB培养基中，每孔加入200 μL菌液至96孔板，5孔重复，于37、42和45 ℃连续检测。通过GraphPad Prism 8.0软件，采用修改的Gompertz模型拟合生长曲线，公式如下：
其中，A：细菌初始数量；C：细菌初始数量和最大数量之间的差值；μ_m：最大比生长率；λ：菌株生长滞后时间。将获得的A值和培养时间的数据分别代入上述公式中的y和t，得到生长拟合曲线。
不同环境条件的细菌菌落形成测试：
温度和pH值应激：样品菌连续10倍稀释，每个稀释浓度取2 μL点于LB琼脂培养基上，分别于37、42和45 ℃静置培养12 h。pH值分别为5.0、6.5和8.5，以pH 7.0的标准LB培养基作为对照，37 ℃培养12 h。
H₂O₂应激：样品菌按1%接种至含H₂O₂（0、1、1.5、2、2.5和5 mmol·L⁻¹）的LB培养基中，室温静置处理3 h，分别进行连续10倍稀释，每个稀释浓度取2 μL点于LB琼脂培养基上，37 ℃静置培养12 h。
细菌存活率统计：将1×10⁻⁴稀释水平的菌液（2 μL）于不同条件下培养12 h后进行菌落统计，每个条件5次重复。
细菌生物膜生成：通过评估细菌细胞在玻璃管上的黏附性，检测生物膜的形成。①将VNP20009样品菌接种至5 mL新鲜生物膜诱导培养基（上述实验条件的LB培养基中添加5×M63培养基），分别于37、42或45 ℃、110 r·min⁻¹培养36 h；②弃菌液，用去离子水洗去结合松散的细菌，室温下用1%结晶紫溶液染色30 min后，在气液交界处出现紫环状生物膜。用去离子水清洗至试管流出液为无色，倒置烘干；③用Image J软件对试管上形成的紫色生物膜进行定量分析。
统计学分析：所有数据结果均用GraphPad Prism 8.0统计软件表示成平均值±标准误［mean ± SEM（standard error of mean）］，两组间差异性分析用t检验，P < 0.05表示具有显著性差异。使用GraphPad Prism 8.0对数据进行作图。
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