2结果与分析
2.1噬菌体形态学观察
从采集到的水样中分离得到一株黄单胞菌噬菌体，根据图1-A所示，该噬菌体噬菌斑透明，直径约1~2 mm。经透射电子显微镜进行形态观察(图1-B，C)发现，该噬菌体是一株长尾噬菌体，头部直径为(48±3)nm，尾部长度为(166±8)nm。根据ICTV国际病毒分类方法将其命名为vB_XaS_HDB2(简称HDB2)。
图1噬菌体HDB2的形态观察
2.2噬菌体宿主谱测定
方中达等通过5个最基本的鉴别品种(IR26、Java14、南粳15、Tetep和金刚30)对全国菌系联合鉴定，将国内黄单胞病菌划分为I、II、III、IV、V、IX 6个致病型，其中I型菌株有21个，占参试菌株的14.00%;II型菌株有23个，占15.33%;III型菌株有11个，占7.30%;IV型菌株有29个，占19.30%;V型菌株有41个，占27.40%;IX型菌株有25个，占16.67%。本试验使用6个致病型的17株黄单胞菌对HDB2进行宿主谱测定。由表1可知，HDB2可以裂解52.9%(9/17)的供试黄单胞菌菌株，其中对Xoo 2068、Xoo 1114、Xoo 1765的裂解效果最好，裂解范围包括了供试菌株的6个不同分型，说明该噬菌体宿主谱裂解的抗原范围较广，具有用于噬菌体鸡尾酒研究的潜力。
2.3噬菌体最佳MOI和一步生长曲线
由图2-A可知，噬菌体HDB2在MOI为0.01时效价有最大值，因此HDB2的最佳MOI为0.01。以时间为横坐标、噬菌体效价为纵坐标绘制噬菌体的一步生长曲线，计算爆发量。由图2-B可知，噬菌体HDB2潜伏期为0~3 h，裂解期为3~5 h，5 h后进入平稳期，裂解量为44 pfu cell-1。
图2噬菌体HDB2的最佳MOI(A)和一步生长曲线(B)
图(A)中标注相同字母代表试验组之间无显著性差异，不同字母代表试验组之间有显著差异(P<0.05)。“lg”表示以10为底的对数。
2.4噬菌体耐受性测定
由图3可知，在4、20、30、37、40、50、60℃下水浴1 h，HDB2的效价无明显变化，在70℃处理下效价约降低0.8个lg，80℃条件下噬菌体效价急剧减少约7个lg，说明HDB2的耐高温能力较强。HDB2在pH为4~11的范围内效价基本保持稳定，在pH为3时效价大约减少5个lg，在pH为12时噬菌体完全失活，由此可见HDB2有一定的酸碱耐受性。把HDB2置于245 nm紫外灯下照射30 min，HDB2效价随时间的增长而逐步降低，25 min后效价低至不可检测，表明HDB2易被紫外线辐射灭活，保证了噬菌体应用的安全性。综上所述，HDB2是一株耐高温、耐酸碱、对紫外线较敏感的噬菌体，具有较好的应用潜力。
图3噬菌体HDB2的温度耐受性(A)，pH耐受性(B)和紫外耐受性(C)
图A、B中标注相同字母代表试验组之间无显著性差异，不同字母代表试验组之间有显著差异(P<0.05)。“lg”表示以10为底的对数。
2.5噬菌体基因组分析
HDB2是一株基因组长为43，697 bp、GC含量为54.31%的线性双链DNA(dsDNA)噬菌体。使用GCView对基因组进行可视化(图4-A)发现，HDB2预测有52个开放阅读框(open reading frame，ORFs)，其中30个被注释为已知功能的蛋白(57.69%)，分为4个功能域，分别是DNA代谢模块、裂解模块、包装模块、结构模块，其中16个为结构模块相关基因，8个为DNA代谢相关基因，4个为裂解基因和2个为包装模块相关基因;剩余的22个ORFs为未知功能的假定蛋白，这些蛋白互相配合，完成噬菌体复制、裂解宿主释放子代的过程。使用在线数据库对噬菌体进行分析发现，HDB2含有一个tRNA编码基因，不存在毒力基因、耐药基因，能够确定HDB2是一株烈性噬菌体，并且其具有应用的安全性。
图4噬菌体HDB2的全基因组可视化图(A)与ANI热图(B)
图A不同颜色代表不同功能的开放阅读框:未知功能的假定蛋白(蓝色)，裂解模块(紫色)，特殊模块(红色)，包装模块(粉色)，结构模块(棕色)。图B显示了不同噬菌体在基因组水平上的相似性，相似性取值范围为0~1，颜色越红，表示相似性越高。
将噬菌体HDB2在NCBI进行BLASTn比对发现，HDB2基因组与Septimatrevirus属噬菌体vB_ Xar_IVIA-DoCa8(ON932082.1)、vB_Xar_IVIA-DoCa1(NC_069745.1)及vB XooS NR08(OQ055246.1)核苷酸序列相似性较高，分别为97.93%、97.89%、97.55%，其覆盖度分别为95%、96%、97%。平均核苷酸相似度(average nucleotideidentity，ANI)是在核苷酸水平上比较2个基因组亲缘关系的指标。ANIm热图不同颜色代表不同ANI数值，颜色越红代表相似度越高。由图4-B可知，HDB2与黄单胞菌噬菌体vB_Xar_IVIA-DoCa8的ANI值最高，为97.74%，初步推断HDB2为Septimatrevirus属噬菌体。
2.6噬菌体蛋白网络结构图与系统发育树分析
利用vConTACT2.0从蛋白质水平研究噬菌体之间的亲缘关系。选取Millardlab数据库病毒序列合集进行共享网络分析。蛋白网络图每个节点代表一个病毒，节点之间的连线显示了病毒簇之间的相关性，图5-A黑色圆圈表示HDB2所在位置，图5-B中不同形状代表不同宿主的噬菌体，不同颜色代表不同的病毒集群。图中共有19，790个节点和911，802条连线，代表了19，790个噬菌体之间的911，802个关系。HDB2位于VC7890病毒簇，与其中的42株噬菌体均具有强关联性。HDB2与其中的vB_Xar_IVIA-DoCa8、vB_Xar_IVIA-DoCa11等32个噬菌体都被归于同一个属(Septimatrevirus)。有10个噬菌体暂未有明确分属，剩下的1个噬菌体被划分为Kilunavirus属。通过系统发育树进一步了解HDB2与其他噬菌体的亲缘关系。系统发育树由结点(node)和进化分支(branch)组成，每一结点代表一个分类单元，而结点之间的线段长度和角度可以反映物种间的进化距离和时间，较长的线段表示物种间亲缘关系较远，而较短的线段表示物种间亲缘关系较近。对HDB2的末端酶大亚基进行BLASTp比对后，选取末端酶大亚基相似度较高的25株噬菌体构建系统发育树。由图5-C可知，HDB2与黄单胞噬菌体Samson(YP_010597508.1)位于同一进化分支，均属于Septimatrevirus属。综上所述，HDB2属于Septimatrevirus属的成员。
图5噬菌体HDB2蛋白网络结构图(A，B)和系统发育树(C)
蛋白网络图由19，790个噬菌体(节点)和911，802个关系(连接线)组成，图A中黑色圆圈代表HDB2所在位置，图B表示HDB2所在的蛋白簇，不同颜色的节点代表不同宿主的噬菌体，不同形状代表不同的种属。图C中不同结点代表不同的种属的噬菌体，线段长度对应进化距离。
2.7噬菌体抑制黄单胞菌试验
根据不同MOI加入相应效价的噬菌体作为试验组，通过混合液细菌浓度(OD600的吸光值)的变化评估HDB2对宿主菌Xoo 2068的防控效果。由图6可知，不同MOI下，HDB2抑菌能力具有一定差异。在前12 h内，各组的OD600值无明显变化;12~48 h，对照组的黄单胞菌进入对数生长期，OD600逐步增长。MOI为100、10、1、0.1时，试验组细菌在前24 h时生长趋势与对照组一致，但在24~36 h时细菌浓度逐渐降低，36 h时细菌浓度降到最低;36 h后细菌浓度再次增加，48 h时这4个试验组OD600值仍然低于对照组，说明在这4个MOI下，HDB2对宿主菌有较好的抑制效果，且MOI越高，抑制效果越明显。MOI为0.01时，虽然细菌浓度也出现了先增后降的趋势，但36 h时细菌生长速度加快，与对照组OD600差异不明显，说明HDB2在MOI为0.01时虽然对Xoo 2068有一定的抑制作用，但不如高MOI的抑菌效果。噬菌体在MOI较低(0.001、0.0001)时，细菌生长趋势与对照组对比未见差异，说明低MOI对细菌几乎没有抑制作用。因此认为使用高浓度的HDB2会对黄单胞菌有更好的抑制效果。
图6噬菌体HDB2对黄单胞菌Xoo 2068的抑制效果
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