摘要：
牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）是支原体属中致病性较强的物种之一，可引起牛以肺炎为主的多种亚急性或慢性传染病，严重阻碍全球养牛业发展。本研究从广东阳江患严重肺炎的病死牛肺脏中成功分离出一株牛支原体（编号YJ-22）。通过菌落形态观察、特异性PCR（靶标P48基因，片段约526 bp）及测序比对（同源性>99.3%）、生化鉴定（符合牛支原体特征：不能利用葡萄糖、精氨酸、明胶、尿素、甘露醇，可利用乳糖）确认其种属。绘制该分离株的生长曲线显示，其在PPLO培养基中于18至45小时活菌数维持在1×10⁸~1×10⁹CCU/mL。致病性试验表明，通过气管注射10 mL 1×10¹⁰CCU/mL菌液连续攻毒3天，可使2~3月龄断奶犊牛出现典型临床症状（发热、咳嗽、喘气、鼻腔黏液增多）和肺部典型病变（肉眼可见肉变、出血，肺部病变评分9分和11分，组织学可见肺结构破坏、炎症浸润、增生）。鼻拭子排菌检测呈阳性。利用BEI灭活的YJ-22菌体制备灭活疫苗免疫兔子，诱导产生特异性IgG抗体（效价≥1:64），表明其具有免疫原性。但体外杀菌试验显示，该阳性兔血清对YJ-22的生长无抑制效应（存活率100%）。本研究为M.bovis的高密度培养、致病机制研究及疫苗（特别是以兔子为模型筛选疫苗株或抗原）研发提供了重要基础。
引言
牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）被认为是支原体属支原体科中致病性较强的物种之一。M.bovis可引起以肺炎为主的亚急性或慢性传染病，还能导致多种其他症状，包括关节炎、乳腺炎、结膜炎、耳炎和妊娠母牛流产等。此外，M.bovis可引起无症状感染，并长期定殖于鼻腔。该病原于1960年代在美国感染牛乳腺炎的病例中首次被检测出，此后在全球大多数国家均有报道。我国于1983年首次从患乳腺炎的病牛中分离到M.bovis，2008年相继报道从肉牛和犊牛肺脏中分离到该病原。目前，全国各地均有M.bovis肺炎疫情的报道。自首次报道以来，M.bovis肺炎已严重阻碍了全球养牛业的发展。
支原体是最小的自我复制的原核生物，直径为0.2~0.3μm，基因组较小（500~2500 kb环状双股DNA），仅含有500~1000个基因。由于其遗传信息有限，支原体缺乏许多酶活性和代谢途径，导致其营养需求复杂，高度依赖宿主，在体外难以实现高密度培养，M.bovis亦不例外。为此，我们对新分离的M.bovis进行了生长特性研究，以期为其高密度培养提供依据。
支原体缺乏细胞壁，因此对许多靶向细胞壁合成的抗生素（如β-内酰胺类、糖肽类如杆菌肽）不敏感。它对多粘菌素、磺胺类、第一代喹诺酮类药物和甲氧苄啶等也具有天然抗性。此外，支原体也容易对其他抗菌药物产生耐药性。因此，研制预防牛支原体肺炎的疫苗迫在眉睫。目前市场上尚无商品化的M.bovis疫苗，这与其缺乏能稳定复现疾病的理想动物攻毒模型密切相关。本研究在分离鉴定的基础上，分析了新分离株YJ-22对犊牛的致病性，并使用兔子模型初步验证了其免疫原性，以期为M.bovis疫苗的研制提供基础。
1材料与方法
1.1病料来源
采集自广东阳江某牛场患严重肺炎的病死牛肺脏组织。病牛临床主要表现为咳嗽、有浓鼻液、消瘦等。
1.2主要试剂
PPLO培养基购自美国BD公司；马血清购自美国Cytiva公司；细菌DNA提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；2×Taq PCR MasterMix购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3病料处理
无菌条件下将采集的肺组织切成小块，取约1 g肺组织加入2 mL含双抗（青霉素、链霉素）的PBS，研磨后6000×g离心10 min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤后备用。
1.4病原分离与纯化
将1.3处理好的肺脏上清液接种到PPLO液体培养基中（含20%马血清），置于37℃培养箱中培养。每隔48 h观察颜色变化并传代。取培养基颜色由红变黄且保持澄清者，传至3代后，取变黄的培养物涂布于PPLO固体培养基（含20%马血清）中。3~5 d后，肉眼观察菌落生长情况并在40-100X显微镜下观察菌落形态，挑取典型的“煎蛋样”（Fried-egg）菌落接种到PPLO液体培养基中。待生长后再次接种固体培养基，重复此“液体-固体”克隆纯化过程3次，获得纯培养物。
1.5 PCR鉴定
参照已发表文献，合成M.bovis特异性检测引物MB-P48-F/MB-P48-R（委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。MB-P48-F：5'-CCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT-3'；MB-P48-R：5'-CTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG-3'。预期扩增片段约526 bp。反应体系（20μL）：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上、下游引物（10μM）各0.5μL，模板2μL，ddH₂O 7μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
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