1.5试验方法
1.5.1菌株的活化与分离
将实验室-80℃超低温冰箱中保存的36株乳酸菌在MRS固体平板上划线，然后将平板置于37℃培养箱中培养24 h。从平板上挑取单菌落进行二次平板划线分离，37℃培养24 h，再次从平板上挑取单菌落。
1.5.2菌株发酵
将挑取的36株乳酸菌的单菌落分别接种于10 mL MRS液体培养基中，于37℃生化培养箱中静置培养16 h。然后按1%的接种量转接于30 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h后，测定样品中磷酸吡哆醛的含量。
1.5.3磷酸吡哆醛标准曲线的制作
将磷酸吡哆醛在超纯水中溶解，配制成浓度分别为0.25，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L和2.5 g/L的标准品溶液，然后通过岛津LC-2010A高效液相色谱仪测定不同含量的磷酸吡哆醛溶液产生的峰面积。以磷酸吡哆醛的含量(g/L)为横坐标，峰面积(mV·min)为纵坐标，绘制磷酸吡哆醛的标准曲线。高效液相色谱的条件为：色谱柱，安捷伦Eclipse plus C18(4.6 mm x 250 mm，5μm)；流动相，磷酸二氢钾缓冲液(pH=6.0):乙腈=70:30；流速，1.0 mL/min；柱温，30℃；检测波长，388 nm；进样体积，10μL。
1.5.4发酵液中磷酸吡哆醛含量的检测
将发酵液移至10 mL无菌离心管中，4℃，7000 r/min离心15 min。用2.5 mL的注射器将上清液经0.22μm滤膜过滤后注入液相瓶，用高效液相色谱仪检测上清液中磷酸吡哆醛的含量。
1.6乳酸菌的益生特性
1.6.1菌株生长曲线及产酸特性
将100μL的乳酸菌菌液接种于10 mL新配制的MRS培养基中，37℃静置培养。每隔2 h取样，测定样品的pH值。然后将样品稀释10倍，测定其在600 nm处的光密度值，绘制菌株的生长曲线与产酸特性曲线。
1.6.2菌株最适生长温度
按照1.0%的接种量将菌液接种于10 mL新配制的MRS培养基中，分别置于25，30，37，42℃和60℃下静置培养18 h测定菌液在600 nm处的光密度值，确定菌株的最合适生长温度。
1.6.3菌株最适pH值
按照1.0%的接种量将菌液分别接种于10 mL新配制的初始pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0和8.0的MRS培养基中，37℃静置培养18 h后，测定其在600 nm处的光密度值，确定菌株的最合适生长pH值。
1.6.4菌株耐过氧化氢能力
在液体MRS培养基中添加过氧化氢，使其终浓度分别为0.25，0.5，0.75 mmol/L和1.0 mmol/L。将100μL乳酸菌菌液接种于上述培养集中，37℃静置培养8 h后，测定其在600 nm处的光密度值，确定菌株对过氧化氢的耐受能力。
1.6.5菌株的耐盐能力
在液体MRS培养基中添加氯化钠，使其质量分数分别为2%，4%，6%，8%和10%。将100μL乳酸菌菌液接种于上述培养集中，37℃静置培养8 h后，测定其在600 nm处的光密度值，确定菌株对氯化钠的耐受能力。
1.6.6菌株的低温耐受能力
取500μL菌液接种至50 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养。当菌液在600 nm的光密度值达到1.0时，将其分装至10 mL无菌离心管中，于-20℃冰箱中冷处理1，3，5，7 d和10 d，分别测定不同冷处理条件下菌株的活菌数。
1.6.7菌株的自凝集能力
将已活化2次的菌液离心，去上清。用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.0)洗涤并重悬菌体，调整细胞浓度为1.0x10^8 CFU/mL，于37℃静置培养。测定上层细胞悬液在不同时间的光密度值。按照下列公式计算菌株的自凝集率。当时间是x h时的OD600 nm记为A_x，初始OD600 nm记为A_0。自凝集率(%)=(1-A_x/A_0)x100。
1.6.8菌株耐酸能力
首先接种200μL的菌液于10 mL初始pH值为7.0的MRS培养基中，37℃静置培养。当菌体在600 nm处的光密度值为1.0时，将其转移至10 mL的无菌离心管中，于4℃，7000 r/min离心15 min。弃上清液。沉淀的菌体经磷酸缓冲液洗涤2次后，将菌体转移至初始pH值分别为2.0，3.0和3.5的MRS培养基中，37℃静置培养。分别于培养0.5，1，2 h和3 h时摇匀取样，测定其活菌数，绘制菌株的耐酸曲线。
1.6.9菌株的耐胆盐能力
接种200μL乳酸菌菌液于10 mL MRS培养基中，37℃静置培养至OD600 nm为1.0。离心去上清液，沉淀的菌体用磷酸缓冲液洗涤2次。将菌体转移至含胆盐浓度分别为0.03%，0.1%和0.3%的MRS培养基中，37℃静置培养，分别于培养0.5，1，2 h和3 h时摇匀取样，测定其活菌数，绘制菌株的耐胆盐曲线。
1.6.10菌株的抑菌能力
接种200μL菌液至10 mL MRS培养基中，37℃静置培养24 h，然后将菌液分装到1.5 mL无菌离心管中，4℃，12000 r/min离心10 min。上清液经0.22μm有机膜过滤。将100μL荧光假单胞菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌分别接种于10 mL LB培养基中，于37℃，180 r/min的条件下培养12 h。取1%的指示菌菌液转接于50 mL LB液体培养基中继续培养至OD600 nm为0.5时，置于冰上备用。将灭菌的MRS固体培养基倒平板，冷却凝固。将半固体LB培养基与2%的备用指示菌菌液混合，轻轻晃匀，倒入已凝固的MRS平板上，待其稍微凝固后立即将灭菌的牛津杯置于固体平板上。在牛津杯中加入200μL经有机膜过滤的发酵上清液。将双层平板放在常温下冷却40 min后，分别于37℃培养箱中培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈的直径。
1.7数据处理
试验重复3次，试验结果以平均值±标准偏差表示。数据分析采用SPSS 17.0软件，数据绘图采用Origin 8.5软件。
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