摘要
本研究开发了一个模型，用于预测产志贺毒素大肠杆菌（VTEC）在发酵生肉香肠（FRMS）整个加工和储存过程中的种群密度。通过收集公开资源中的概率和动力学测量数据集，并在需要时补充新的测量数据，量化了VTEC生长和灭活对温度、pH、水分活度（a_w）和乳酸浓度的依赖性。将预测结果与在中试工厂生产的VTEC污染FRMS中的观察结果进行了比较。根据发酵温度（24°C或34°C）预测了VTEC减少的微小差异，在最高温度下灭活程度更大。在高温储存期间观察到最大的减少。在25°C下储存66天后，观察到种群数量减少超过6个十进制对数单位，而在12°C下仅检测到约1个对数单位的减少。评估了我们的模型和其他建模方法在干制和半干制FRMS加工过程中的性能。预测在干燥期长的干制FRMS中VTEC灭活程度最大，而在干燥期短的半干制FMRS中减少最小。该模型已在一个名为E.coli SafeFerment（EcSF）的计算工具中实现，EcSF整合了生长、生长概率、热灭活和非热灭活模型，以预测在恒定或波动的环境条件下FRMS制造和储存过程中的VTEC浓度。
引言
产志贺毒素大肠杆菌（VTEC），包括血清型O157:H7，是引起人类严重食源性疾病的病原体。VTEC的一个亚群能够引起出血性结肠炎（HC）和溶血性尿毒症综合征（HUS），构成肠出血性大肠杆菌（EHEC）。其中，一系列血清群（即O157、O26、O103、O91、O145和O111）与公共卫生问题非常频繁地相关。
牛是VTEC的主要储存宿主。传播主要通过食用未煮熟的受感染牛肉、未经巴氏消毒的乳制品、蔬菜或受污染的水发生。也有报道人际传播。与食源性大肠杆菌O157:H7暴发相关的剂量估计在2到2,000个细菌之间。如此低的剂量意味着这种微生物不需要在产品中生长就能引起疾病。在美国，VTEC每年估计导致260,000例疾病，3,700例住院和20例死亡。在欧洲，估计每年病例数约为3,000至4,000例。
发酵生肉香肠（FRMS）是通过发酵、干燥、香料、盐、亚硝酸钠以及Starter培养物活性产生乳酸并降低培养基pH值的组合来抑制病原菌生长和/或存活的产物。已报道了几起涉及被VTEC污染的FRMS的食源性暴发。在欧盟，碎肉和/或发酵肉及其制品因可能受VTEC污染而被视为对公共卫生构成危害。在美国，发酵香肠生产过程中要求大肠杆菌种群减少5个对数单位，而所需减少量为3个对数单位。
由VTEC引起的食源性暴发数量不断增加，促使人们努力了解其在几种环境条件下的种群动态，包括生长和衰减速率以及生长限制。预测食品中大肠杆菌和其他细菌种群动力学的模型可在几个公共资源获得，例如ComBase门户网站、PMP或FoodRisk.org。大肠杆菌生长对环境的依赖性已在广泛的食品条件下建模。在肉汤和包括FMRS在内的食品中也估计了大肠杆菌的生长/无生长边界和灭活。具体来说，大肠杆菌O157:H7的灭活已被建模为由于Starter培养物和酵母在橄榄发酵过程中的代谢活动导致的培养基变化函数，以及作为pH和水分活度（a_w）在soudjouk式发酵香肠发酵和干燥过程中的函数。公开可用的软件THERM根据生肉产品的时间-温度历史预测大肠杆菌O157:H7和其他病原体的生长或不生长；更具体地说，澳大利亚食品安全卓越中心提供了实现预测生肉中和发酵肉制品中大肠杆菌O157:H7灭活的工具。然而，预测VTEC在涵盖FRMS制造和储存特有的生长和无生长环境范围内的响应尚未得到解决。
这项工作的目的是量化VTEC在FRMS制造和储存条件下的响应，并开发一个用户友好的动态建模框架来预测这些过程中VTEC生物的浓度。我们在文献和公开数据源中进行了广泛搜索，涉及实验室培养基和食品中不同温度、pH、a_w和乳酸条件下的生长和灭活速率以及生长/无生长限制。此外，还实验生成了新数据以解决数据空白，并在中试工厂制造了FRMS，以评估模型对制造和储存过程中VTEC种群密度的预测。
为了促进模型的应用，它已被实现为一个名为E.coli SafeFerment（EcSF）的Excel加载项。EcSF工具结合了生长、生长概率和灭活模型，以预测在恒定或波动的环境条件下FRMS生产和储存任何阶段的VTEC浓度。
材料与方法
数据收集
用于开发VTEC模型的数据集来自ComBase数据库或文献，或由塔斯马尼亚大学食品安全中心友好提供。本工作还生成了额外数据以解决数据空白（见补充材料中的表S1）。补充材料中的表S2显示了公开数据和新生成数据中使用的血清型和菌株。
数据生成
(i)菌株、接种物和培养基制备
本工作使用两种产志贺毒素大肠杆菌菌株来测量非热灭活速率，并在各种温度、pH、a_w组合以及几种乳酸浓度下生成生长/无生长观察结果。这些是2006年挪威由含有羊肉牛肉（morr）的发酵香肠引起的暴发中涉及的O103:H25菌株，以及2002年瑞典由冷熏发酵香肠引起的暴发中涉及的O157:H7 218菌株。
使用先前构建并评估了在各种环境条件下实验室培养基中生长和灭活的利福平抗性（Rif'）菌株大肠杆菌O157:H7 218Rif和O103:H25 Rif'来接种FRMS。在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB;Oxoid,United Kingdom）和pH 5.5含10,000 ppm乳酸的TSB中评估了野生型和Rif突变菌株的生长；在pH 4.0、a_w值等于0.90含45,000 ppm乳酸的TSB中测量了灭活。在所有测试条件下，Rif菌株的生长和灭活响应与野生型菌株相同（数据未显示）。
菌株培养物在-70°C下用20%甘油保存。实验前，将野生型菌株的接种物在37°C的TSB中连续三次传代培养24小时。Rif菌株接种物按先前描述制备。需要时，用6 N NaOH和1 N HCl无菌调节培养基pH，并在高压灭菌前向培养基中加入乳酸（90.08 g/liter;90%acid）和NaCl。水分活度基于TSB中补充NaCl（已含0.5%），并根据方程a_{w}=-0.0071times percent NaCl+1.0054text{估计，如先前报道}。
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