乳酸乳球菌的包埋体系LL@Fe-TA@mGN 生长曲线测定及胃肠道抗性与体内滞留能力（二）-上海谓载科技有限公司

乳酸乳球菌的包埋体系LL@Fe-TA@mGN 生长曲线测定及胃肠道抗性与体内滞留能力（二）

来源：中国食品学报发布时间:2025-09-11 18:50:34 浏览：7 次

1.3 改性葡聚糖包埋乳酸乳球菌体系的构建

参考本课题组以往方法并加以改进。LL 接种于8 mL MRS 液体培养基中，并置于37 ℃的恒温培养振荡器中培养过夜。培养结束后离心（6 000 r/min，4 min）获得菌泥，并用PBS 缓冲液洗涤菌泥2 次。随后将菌泥重悬于1 mL PBS 缓冲液中，备用。将100 μL 菌悬液（活菌数约为1×108 CFU/mL）、10 μL TA 溶液（40 mg/mL）和10 μL FeCl3 溶液（10 mg/mL）分别加入880 μL PBS 缓冲液中，涡旋60 s，使其在LL 表面形成牢固的金属-酚醛网络（Fe-TA）结构，获得LL@Fe-TA 体系。用PBS 缓冲液洗涤该体系2 次，以除去未反应的TA和Fe3+。将LL@Fe-TA 体系重悬于990 μL 的PBS缓冲液中，随后加入10 μL 不同质量浓度的mGN，使得mGN 在体系中最终质量浓度为0～0.2 mg/mL，并获得羧甲基化β-葡聚糖包埋乳酸乳球菌体系LL@Fe-TA@mGN。最后用PBS 缓冲液洗涤2 次，以除去体系中多余的mGN。

1.4 LL@Fe-TA@mGN 的粒径与电位分析

取1 mL 新鲜制备的LL@Fe-TA@mGN 稀释于9 mL 去离子水中，轻轻涡旋，使其充分分散于离心管中，使用激光粒度分析仪对LL@Fe-TA@mGN 的粒径与电位进行测定。

1.5 LL@Fe-TA@mGN 的生长曲线测定

将LL@Fe-TA@mGN 按照2%（体积分数）的接种量接种于新鲜的MRS 液体培养基中。将该体系置于37 ℃的恒温培养箱中，轻轻摇晃，以未接种的MRS 液体培养基作为空白组，未包埋的LL作为对照组。培养0，2，4，6，8，10，12 h 后，使用酶标仪测定菌株在波长600 nm 处的OD 值。

1.6 LL@Fe-TA@mGN 的微观形态分析

根据Feng等的方法，使用SEM 观察LL@Fe-TA@mGN 的表面形态。将MRS 液体培养基中的菌体样本离心（6 000 r/min，4 min）并去除上清液，用PBS 缓冲液洗涤3 次。随后将沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定3 h。紧接着被固定的样本用PBS 缓冲液洗涤3 次，再用清水洗涤2 次。用体积分数30%，50%，70%，80%，90%的乙醇溶液连续对样本进行脱水，每次脱水15～20 min。之后用100%的乙醇溶液脱水2 遍，每次脱水15～20 min。使用干燥箱在40 ℃下对样品进行干燥10～15 min，随后进行喷金并上样观察。将1 滴细菌悬浮液小心地沉积在Formvar/carbon 200 目网格上并在空气中干燥，随后进行TEM 观察。

1.7 LL@Fe-TA@mGN 的胃液与胆盐耐受性研究

将等量LL 和LL@Fe-TA@mGN（1×109 CFU/mL）分别转移到1.6 mL 新鲜的模拟胃液中（Simulated gastric fluid，SGF；pH 2.5，1 000 mL 蒸馏水，5 g 胃蛋白酶，8.5 g NaCl）和4%胆汁盐中。然后，在37 ℃，200 r/min 的摇床条件下孵育。在预定时间点（0，1，2 h）取300 μL 反应溶液，离心（6 000 r/min，4 min）得到沉淀，并用PBS 缓冲液洗涤2 次。在连续稀释后，将获得的细菌悬液涂布在固体MRS 平板上。37 ℃孵育24 h 后，进行菌落计数。

1.8 LL@Fe-TA@mGN 的体内滞留成像

将10 只C57BL/6J 小鼠（禁食12 h）分为2组，分别口服Cy5 标记的LL@Fe-TA@mGN 和LL（1×109 CFU/mL）。使用活体成像系统在小鼠口服给药后预定时间点（4 h，8 h）获取小鼠活体胃肠道图像。

1.9 数据处理与分析

采用GraphPad Prism 8 进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示。统计学显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA）。*：P ＜0.05；**：P ＜0.01；***：P ＜0.001；****：P ＜0.0001。

2 结果与分析

2.1 LL@Fe-TA@mGN 的粒径与电位

粒径与电位分析是验证益生菌包埋是否成功的重要手段。当使用具有不同电势的壁材包埋益生菌时，所得益生菌包埋体系的整体带电情况会发生相应改变。Anselmo等利用层层自组装的方法对芽孢乳酸菌进行包埋，未包埋的益生菌带有负电，包裹上一层壳聚糖后，体系变成正电，随后在最外层包裹上带负电的海藻酸钠，使体系的整体电势变成负电。Liu等也通过粒径与电位的变化来说明益生菌的包埋情况。本研究中，通过LL@Fe-TA@mGN 的粒径与电位分析，确定了LL的包埋情况与最外层mGN 的最佳使用剂量。如图1 和图2 所示，相对于未包埋的LL，LL@Fe-TA@mGN 的粒径与电位都有显著变化，说明mGN被金属-酚醛网络结构（Fe-TA）吸附在LL 的表面。当包埋LL 的mGN 质量浓度为0.12 mg/mL时，LL@Fe-TA@mGN 的粒径和zeta-电位都达到峰值，表明在该质量浓度下，单个LL 被mGN 完全包裹。

图1 包埋过程中使用的mGN 质量浓度（0～0.2 mg/mL）对LL@Fe-TA@mGN 粒径的影响

注：*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。

图2 包埋过程中mGN 质量浓度（0～0.2 mg/mL）对LL@Fe-TA@mGN zeta-电位的影响

注：*.P ＜0.05。

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