3．缺失株ΔvgrG的构建：
根据NCBI公布的Kpn vgrG ORF序列(NCBI Reference Sequence:NC_016845.1)设计引物，经PCR分别扩增vgrG上下游同源臂序列，再经过融合PCR扩增同源臂融合片段。回收纯化后的同源臂融合片段和质粒pKO3-Km分别用限制性内切酶NotⅠ进行酶切，再用T4连接酶进行连接，连接产物转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，经菌液PCR鉴定并测序正确。重组质粒pKO3-Km-vgrG转化入Kpn感受态细胞，经同源重组整合，筛选出构建成功的缺失株KpnΔvgrG。引物序列见表1，引物由苏州金唯智生物科技合成。
4．回补株CΔvgrG的构建：
根据NCBI的Kpn基因组序列扩增得到vgrG启动子及其全基因片段，经限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ对质粒pBAD33进行双酶切，将酶切后的载体与扩增片段通过同源重组酶连接，连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，经菌液PCR鉴定并测序正确。将重组质粒pBAD33-vgrG转入ΔvgrG株感受态细胞，涂板37℃培养至长出单菌落，经PCR鉴定含有重组质粒的菌株，即为回补株CΔvgrG。引物序列见表1，引物由苏州金唯智生物科技合成。
5．生长曲线试验：
将野生株WT、ΔvgrG株和CΔvgrG株的单菌落分别接种于15 ml LB培养基中，37℃200 r/min培养过夜，次日按1∶100转接至50 ml LB液体培养基中，37℃200 r/min振荡培养。每隔2 h测定菌液A 600值，连续检测24 h，每个时间点重复检测3次。使用软件GraphPad Prism 8.0绘制生长曲线。
6．沉淀离心试验(黏度试验)：
挑取平板菌落至LB液体培养基中(CΔvgrG株培养基加入1.5%阿拉伯糖)，37℃200 r/min培养至A 600值为2.0左右，5 000 r/min离心10 min(离心半径15 cm)后吸取上清测定A 600值，比较不同菌株上清的吸光度值以反映菌体黏度。
7．人肺上皮细胞A549黏附试验：
将2×10 5个A549细胞至24孔细胞板，贴壁后将培养至对数期的新鲜Kpn菌液按照MOI＝20感染细胞5 h，PBS洗3次，0.5%Triton X-100裂解细胞，裂解液于LB平板培养，统计黏附的细菌克隆数。
8．小鼠巨噬细胞Raw264.7吞噬试验：
将Raw264.7细胞铺于12孔细胞板，细胞密度为5×10 5个/ml。将培养至对数期的Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株菌液按照MOI＝20感染细胞，感染2 h后更换为含100μg/ml庆大霉素的DMEM培养1 h杀灭胞外菌，最后更换为含10μg/ml庆大霉素的DMEM继续培养6 h和12 h，0.5%Triton X-100裂解细胞，裂解液于LB平板培养，即为胞内存活的细菌克隆数。
9．小鼠存活率试验：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以致死剂量1×10 8 CFU经鼻腔注射感染小鼠。感染后连续观察10 d，统计存活率。
10．小鼠脏器细菌载量试验：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以半致死剂量(5×10 7 CFU)经鼻腔注射感染小鼠，感染后第3天收集肺脏并研磨，悬液中细菌通过倍比稀释进行计数。
11．统计学方法：
应用GraphPad Prism 8.0统计软件分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，采用线性回归进行相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．成功构建ΔvgrG株和CΔvgrG株：
以高保真酶PCR扩增出vgrG的上游同源臂和下游同源臂，大小均为524 bp，拼接后连接至自杀载体。自杀载体pKO3-Km-vgrG导入Kpn WT株，经同源重组整合，获得了敲除vgrG的无痕缺失株。经特异性引物鉴定，WT株中存在vgrG而缺失株中无法扩增出vgrG序列(图1)。再以高保真酶PCR扩增出vgrG的启动子区域及完整开放阅读框，大小为3 039 bp，连接至表达载体pBAD33。将pBAD33-vgrG导入ΔvgrG感受态细胞。经特异性引物鉴定，CΔvgrG株构建成功(图2)。
vgrG同源臂扩增与ΔvgrG株PCR鉴定
注：M：DL2000 marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：上下游同源臂；4：pKO3-Km-vgrG载体鉴定；5：阴性对照；6：WT株；7：ΔvgrG株；8：阴性对照
vgrG序列扩增与CΔvgrG株PCR鉴定
注：M：DL2000 marker；1：vgrG PCR扩增序列；2：pBAD33-vgrG载体鉴定；3：阴性对照；4：WT株；5：ΔvgrG株；6：CΔvgrG株；7：阴性对照
2．vgrG基因缺失后细菌的体外生长能力测定：
为观察vgrG是否对体外生长产生影响，每2 h用酶标仪测定不同菌株在LB培养基中的A 600值，测至细菌生长平台期。结果显示无论在对数期(4~8 h)还是最终的平台期(12 h以后)，WT株和ΔvgrG株生长速度没有显著区别[(1.40±0.10)vs(1.20±0.30)，t＝0.63，P>0.05]，ΔvgrG株和CΔvgrG株之间也没有显著区别(P>0.05)。以上结果表明vgrG不参与细菌的体外生长(图3A)。
细菌体外生长曲线与黏度测定
注：A：细菌体外生长曲线；B：细菌离心后上清液吸光度(A)值
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