3讨论
3.1RdrA对F44菌株耐酸性能的影响
对F44、△rdrA和FrdrA菌株的酸耐受等表型试验得出，△rdrA菌株耐酸性能极显著提升，说明转录因子RdrA影响酸应激相关基因的表达，调节细胞代谢活动，抑制F44菌株的酸耐受能力。课题组前期研究发现，乳酸乳球菌F44中转录因子YthA参与ADI途径，促进精氨酸生物合成和极性氨基酸转运，以此提升菌株酸耐受能力。乳酸乳球菌NZ9000中转录因子LssR通过上调ADI通路和表面多糖生物合成通路中的部分基因表达，帮助菌株响应酸胁迫。研究转录因子对耐酸性能的影响有助于进一步解析乳酸菌的耐酸机制。
3.2RdrA对F44菌株酸胁迫响应的研究
3.2.1RdrA对细胞壁合成与修饰的影响
如表4所示，相较于F44原始菌株，△rdrA菌株中plpA、plpB、plpC基因转录量分别上调1.04、1.23、1.24倍。根据KEGG代谢通路注释，它们均属于MetQ家族，编码ABC转运蛋白(MetNIQ)中的底物结合蛋白(Substrate-bindingprotein,SBP)。这些蛋白位于细胞膜或跨膜结构域上，通过特异性识别D-蛋氨酸及其衍生物，使跨膜域构象改变，从而完成底物向胞质运输的过程。
研究表明，细菌可以通过利用D-蛋氨酸修饰细胞壁肽聚糖，以此促进菌株酸耐受能力。在大肠杆菌、棒状杆菌、植物乳杆菌等多种细菌中，D-蛋氨酸能够替代细胞壁肽聚糖部分位点的原有氨基酸，修饰细菌细胞壁肽聚糖结构。在乳酸乳球菌F44中，D-蛋氨酸可以替换至肽聚糖胞壁肽的第5位，并且通过这种细菌细胞壁修饰作用提高菌株在酸胁迫环境下的存活率和Nisin产量。
在△rdrA菌株中，细胞可能通过调节D-蛋氨酸转运的过程，以适应或补偿由于RdrA缺失造成的生理变化。转录因子RdrA通过下调D-蛋氨酸向胞质转运水平，抑制细胞壁的合成与修饰过程，进而降低乳酸乳球菌F44的酸耐受和Nisin耐受能力。
3.2.2RdrA对氨基酸合成与代谢的影响
如表4所示，△rdrA菌株中cysD基因转录量上调1.01倍。根据KEGG代谢通路注释，cysD编码O-乙酰高丝氨酸巯基酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)。在谷氨酸棒状杆菌中，氧-乙酰-高丝氨酸(O-Acetyl-L-homoserine)和甲硫醇(Methanethiol)经MetY(CysD同源蛋白)催化生成蛋氨酸和醋酸盐。这一途径相较于由天冬氨酸合成蛋氨酸的途径，需要的NADPH水平较低，而且不需要最终的甲基化过程，减少了碳流失。
有研究指出，在酸性环境下，提高植物乳杆菌胞内的蛋氨酸水平，不仅可以降低同型半胱氨酸积累产生的毒性作用，还可以提高细胞膜中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例，维持细胞膜结构完整性，从而增强植物乳杆菌细胞的酸耐受能力。
这些发现表明，转录因子RdrA通过降低O-乙酰高丝氨酸巯基酶的合成水平来抑制蛋氨酸合成途径，致使细胞毒性累积及细胞膜的饱和脂肪酸比例失调，进而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.3RdrA对DNA修复的影响
如表4所示，△rdrA菌株中DYH_g1322基因转录量上调1.67倍。DYH_g1322被eggNOG数据库注释为DNA重组修复蛋白RecT编码基因。RecT参与同源重组过程，对修复DNA损伤，维持基因组稳定起到关键作用。在大肠杆菌中，RecET构成一种同源重组途径，外切酶VIII(recE编码)以5'-3'的方向降解线性双链DNA，暴露单链DNA后由RecT蛋白介导完成同源重组，促进修复断裂的双链DNA。Zhu等发现，在乳酸乳球菌NZ9000中过表达来自大肠杆菌MG1655和乳酸乳球菌A76的recT基因可以提高NZ9000菌株在乳酸、盐和乙醇胁迫下的耐受能力以及细胞内三磷酸腺苷浓度，表明酸应激条件下RecT蛋白表达量提升能够提高菌株酸耐受能力。
因此，转录因子RdrA通过下调重组修复蛋白表达，抑制DNA修复途径，进而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.4RdrA对蛋白修饰的影响
如表4所示，△rdrA菌株中yhjG基因转录量上调1.01倍。根据eggNOG数据库注释，yhjG编码蛋白N-乙酰基转移酶(ProteinN-acetyltransferase)。有研究指出，在结核分枝杆菌mc(2)155中，rimI基因(与yhjG基因具有同源性)的过表达可以显著提升菌株的酸耐受性以及对其他多种环境胁迫的耐受能力。
△rdrA菌株酸耐受性增强可能与yhjG基因表达量的上调有关。N-乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，这种修饰可能通过改变蛋白质的结构和功能，或通过影响蛋白质的稳定性和降解速率，来帮助细菌适应酸性环境。这一发现为理解细菌如何通过翻译后修饰来适应环境压力提供了新的视角。
3.2.5RdrA对F44菌株耐酸性能的影响
通过分析显著差异表达基因功能，总结了RdrA影响耐酸性能示意图，如图7所示。RdrA主要通过抑制D-蛋氨酸转运结合蛋白(PlpA、PlpB、PlpC)的表达，降低细胞被膜的稳定性，从而使F44菌株对酸胁迫和Nisin胁迫的耐受能力下降。同时，转录因子RdrA还通过降低O-乙酰高丝氨酸巯基酶(CysD)、DNA重组修复蛋白(DYH_g1322)和蛋白N端乙酰基转移酶(YhjG)的表达水平，抑制蛋氨酸合成、DNA修复和蛋白质翻译后修饰这些细胞关键生理过程的活性。这些发现为理解RdrA在细菌耐酸调控中的作用提供了新的见解，并为未来提高工业生产菌株的耐酸性提供了潜在的分子靶点。
图7转录因子RdrA影响耐酸性能示意图
4结论
研究揭示了乳酸乳球菌F44中与耐酸性能相关的DeoR/GlpR家族转录因子RdrA的作用。rdrA突变并不影响菌株生长情况，然而在pH3.0的酸性环境下，rdrA缺陷型菌株的细胞存活率极显著提高，并且增强Nisin耐受性能。转录组分析和qPCR验证结果表明，转录因子RdrA抑制了D-蛋氨酸转运结合蛋白表达，降低了O-乙酰高丝氨酸巯基酶表达水平，抑制了DNA分子修复和蛋白修饰过程，使乳酸乳球菌F44耐酸能力下调。此外，RdrA削弱细胞被膜的流动性和韧性，降低了F44菌株对Nisin胁迫的耐受能力。对RdrA潜在的调控靶标进行预测和分析，有助于完善乳酸乳球菌的酸耐受机制，为理解乳酸菌如何在酸性环境中维持稳定性和功能性提供新的视角，助力进一步改造发酵工业菌株。
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